Оценка влияния индукции цитохрома Р450 на генотоксичность тетрахлорметана in vitro

Введение. Одним из этапов патогенеза токсического действия тетрахлорметана является образование соединений активных форм кислорода с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), приводящих к модификации азотистых оснований. Частота образования модифицированных азотистыми оснований нуклеотидов коррелирует с количеством одно- и двухцепочечных разрывов молекул ДНК. Инициатором образования активных форм кислорода и перекисного окисления липидов в клетках печени при поступлении тетрахлорметана является трихлорметильный радикал, образующийся при биотрансформации микросомальными ферментами цитохрома Р450.

Цель исследования — проанализировать изменения генотоксичности тетрахлорметана в гепатоцитах при нормальной и повышенной активности цитохрома Р450, вызванной воздействием индуктора (совола).

Материалы и методы. Оценка генотоксичности выполнена методом ДНК-комет после затравки тетрахлорметаном культуры гепатоцитов мыши МН22а в 96-луночных микропланшетах без индукции цитохрома Р450 и при химической индукции цитохрома Р450 соволом. Определение содержания ДНК в хвосте комет (%), длины хвоста комет (мкм) и момента хвоста проводили в программе ImageJ 1.48. Статистический анализ результатов выполнен в программе SPSS Statistics 21.

Результаты. Представлены экспериментальные данные о генотоксическом воздействии тетрахлорметана на гепатоциты клеточной линии МН–22а без индукции цитохрома Р450 и при химической индукции цитохрома Р450 соволом. Обнаружено, что 0,5 мМ раствор тетрахлорметана через 1 час после добавления в культуральную среду является генотоксичным для гепатоцитов MH–22a без применения совола (р<0,001). Отсутствие определяемых с помощью метода ДНК-комет признаков генотоксичности 5 мМ тетрахлорметана (р>0,05) в культуральной среде, вероятно, объясняется переходом клеток в состояние паранекроза. Генотоксический эффект не выявляется методом ДНК-комет после 3 и 24 часов инкубации гепатоцитов МН–22а с 0,5 и 5 мМ растворами тетрахлорметана без прединкубации с соволом (р>0,05), что может указывать на репарацию возникших повреждений. После 72 ч предварительной инкубации гепатоцитов с соволом и следующей за ней четырехчасовой затравки клеток 2,5 мМ раствором тетрахлорметана наблюдаются более высокие значения параметров ДНК-комет, чем при затравке тетрахлорметаном без инкубации с соволом (p<0,05).

Выводы: По итогам проведенного исследования 72 ч индукции цитохрома Р450 соволом повышает генотоксичность тетрахлорметана in vitro, по сравнению с 24 ч воздействия индуктора, что может косвенно указывать н  а более высокий уровень образовавшихся активных форм кислорода, вызванный повышенной соволом активностью ферментов цитохрома Р450. 

1. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие меха-низмы токсического действия. Л.: Медицина; 1986.

2. Мышкин В.А., Ибатуллина Р.Б., Бакиров А.Б. Поражение печени химическими веществами (функционально-метаболические нарушения, фармакологическая коррекция). Уфа: «Гилем»; 2007.

3. Гривенникова В. Г, Виноградов А. Д. Генерация актив-ных форм кислорода митохондриями. Усп. биол. хим. 2013; 53:245-96.

4. Balbo S., Turesky R. J., Villalta P. W. DNA adductomics. Chem. Res. Toxicol. 2014; 27(3): 356-66. DOI: 10.1021/tx4004352.

5. Linhart K., Bartsch H., Seitz H. K. The role of reactive oxygen species (ROS) and cytochrome P-450 2E1 in the generation of carcinogenic etheno-DNA adducts. Redox Biol. 2014; 3: 56-62. DOI: 10.1016/j. redox. 2014.08.009.

6. Yamazaki H. Fifty years of cytochrome P450 research. Tokyo: Springer; 2016. DOI: 10.1007/978-4-431-54992-5.

7. Ching E. W. K., Siu W.H.L., Lam P.K.S. et al. DNA adduct formation and DNA strand breaks in green-lipped mussels (Perna viridis) exposed to benzo[a]pyrene: dose-and time-dependent relationships. Marine Poll Bull. 2001; 42(7): 603-10. DOI: 10.1016/S0025-326X(00)00209-5.

8. Lloyd D. R., Carmichael P. L., Phillips D. H. Comparison of the formation of 8-hydroxy-2‘-deoxyguanosine and single- and double-strand breaks in DNA mediated by fenton reactions. Chem. Res. Toxicol. 1998; 11(5): 420-27. DOI: 10.1021/tx970156l.

9. МР 4.2.0014-10 «Оценка генотоксических свойств ме-тодом ДНК-комет in vitro»: Методические рекомендации. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнад-зора; 2011.

10. Haschek W. M., Rousseaux C.G., Wallig M.A. et al. (ed.). Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology. New York: Academic Press; 2013. DOI: 10.1016/C2010-1-67850-9.

11. Fouw J. Environmental Health Criteria 208, Carbon Tetrachloride. Geneva: World Health Organization; 1999.

12. Белицкий Г. А., Фонштейн Л.М., Худолей В.В. и др. Совол как индуктор микросомальных ферментов, активирующих проканцерогены. Экспериментальная онкология. 1987; 9(3): 20-3.

13. Вредные химические вещества. Галоген- и кислородсодержащие органические соединения/А.Л. Бандман, Г.А. Войтенко, Н.В. Волкова и др.: Под ред. В.А. Филова и др. СПб: Химия; 1994.

14. ГОСТ 32638-2014 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro. [Текст]. Введ. 2015-06-01. М.: Стандартинформ, 2015.

15. Barrett J. C., Vainio H., Peakall D. et al. 12th meeting of the Scientific Group on Methodologies for the Safety Evaluation of Chemicals: susceptibility to environmental hazards. Environ Health Perspect. 1997; 105(Suppl. 4): 699-737. DOI: 10.1289/ ehp. 97105s4699.

16. Ludewig G., Robertson L. W. Polychlorinated biphenyls (PCBs) as initiating agents in hepatocellular carcinoma. Cancer Lett. 2013; 334(1): 46-55. DOI: 10.1016/j. canlet. 2012.11.041

17. Насонов Д. Н., Александров В.Я. Реакция живого веще-ства на внешние воздействия. Л.: Изд-во АН СССР; 1940.

18. Dai Y., Cederbaum A. I. Inactivation and degradation of human cytochrome P4502E1 by CCl4 in a transfected HepG2 cell line. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275(3): 1614-22.

19. Murugesan P., Muthusamy T., Balasubramanian K., et al. Polychlorinated biphenyl (Aroclor 1254) inhibits testosterone biosynthesis and antioxidant enzymes in cultured rat Leydig cells. Reproductive Toxicol. 2008; 25(4): 447-54. DOI: 10.1016/j. reprotox. 2008.04.003.