Введение. Прооксиданты — это вещества, способные вызывать окислительный стресс посредством генерации активных форм кислорода (АФК). Данные вещества могут иметь различную химическую природу от простых неорганических молекул таких как пероксид водорода, озон, соли переходных металлов, до более сложных органических соединений таких как хлорорганические соединения, алкилгидразины и др. Механизм прооксидантного действия этих веществ также различен, молекулы веществ могут как сами по себе являться источниками АФК, например в процессе реакции Фентона пероксид водорода переходит в  гидроксильный радикал, так и катализировать реакции синтеза АФК, например соли переходных металлов являются катализаторами реакции Фентона. Кроме того, некоторые вещества могут не обладать прооксидантными свойствами сами по себе, но при поступлении в организм человека вызывать окислительный стресс за счёт химического взаимодействия с различными ферментными системами, такими как дыхательная цепь митохондрий [1], система цитохрома P450 [2], НАДФН оксидазами [3] и др. Прооксиданты находят широкое применение в таких отраслях народного хозяйства как, здравоохранение, химическая промышленность, пищевая промышленность, сельское хозяйство, жилищно-коммунальное хозяйство и многих других, их экономическое значение трудно переоценить.

В настоящее время при формировании программы экспериментальных исследований гигиенического нормирования веществ ключевую роль играет определение наиболее вероятных органов-мишеней, в то время как для прооксидантов более целесообразным было бы учитывать особенности их химического взаимодействия с организмом, а также реакцию организма на это взаимодействие. Учитывая, что прооксидантную активность проявляют многие соединения, разработка специфичных подходов к её оценке является актуальной задачей профилактической токсикологии.

Известно, что одним из наиболее ранних ответов организма на окислительный стресс является активация его антиоксидантных систем [4], что позволяет связать действие химического фактора с ранними изменениями клеточного гомеостаза ещё до формирования выраженного морфологического и функционального повреждения. Для гигиенической оценки веществ это имеет принципиальное значение, так как именно на этом этапе формируются компенсаторные реакции, определяющие границу между адаптацией, обратимым повреждением и последующей патологией [5, 6]. В отечественной практике нормирования химических веществ также подчёркивается необходимость учёта чувствительных биологических критериев, позволяющих обосновывать безопасные уровни воздействия в объектах среды обитания¹.

В настоящей работе в качестве модельного прооксиданта был выбран пероксид водорода (ПВ), который занимает особое положение среди окислителей. С одной стороны, он является реакционноспособным соединением и при определённых условиях способен участвовать в образовании высокоактивных радикалов. С другой стороны, ПВ является физиологической redox-сигнальной молекулой, участвующей в регуляции транскрипционных, метаболических и адаптационных процессов [7, 8]. Поэтому оценка его биологического действия не может ограничиваться регистрацией конечных признаков токсичности. Не менее важным является анализ ранних молекулярных перестроек, отражающих попытку ткани удержать редокс-гомеостаз при длительном поступлении окислителя. Интерес к ПВ поддерживается его применением в технологиях обеззараживания и водоподготовки. В отечественных работах рассматриваются возможности обработки природной воды, сточных вод и воды плавательных бассейнов с использованием пероксидных соединений [9–11]. При этом токсикологическая интерпретация хронического поступления малых и средних доз ПВ остаётся недостаточно разработанной. Имеются данные о пероральной токсичности ПВ в экспериментальных моделях, а также о его влиянии на redox-статус, энергетический обмен и экспрессию генов в печени [12, 13].

Прооксиданты могут влиять на функцию практически всех органов и систем организма. В качестве органа-детектора нами была выбрана печень, которая, являясь важнейшим органом, обезвреживающим химические вещества, оказывается одной из основных мишеней токсического действия прооксидантов. При энтеральном поступлении соединений именно гепатоциты первыми испытывают нагрузку, связанную с биотрансформацией ксенобиотиков, обезвреживанием промежуточных продуктов и поддержанием энергетического обмена [14]. В связи с этим молекулярные реакции печени часто опережают изменения стандартных биохимических показателей и могут использоваться для выявления ранних признаков напряжения антиоксидантной защиты.

Среди большого разнообразия генов, экспрессия которых изменяется в ответ на действие прооксидантов, была выбрана система NFE2L2/Nrf2-Keap1-ARE. Эта система является одним их ключевых регуляторов антиоксидантного ответа организма. Ген NFE2L2 кодирует транскрипционный фактор Nrf2, который при окислительном или электрофильном стрессе высвобождается из комплекса с Keap1, транслоцируется в ядро и активирует гены, содержащие антиоксидант-респонсивный элемент [15–18]. Для печени эта система имеет особое значение, поскольку Nrf2 связывает redox-регуляцию, промежуточный обмен и ферментативную детоксикацию, ограничивая повреждение гепатоцитов при химическом стрессе [18, 19].

Среди Nrf2-зависимых мишеней особое место занимают гены семейства глутатион-S-трансфераз. Данные ферменты катализируют конъюгацию электрофильных соединений с восстановленным глутатионом и участвуют в нейтрализации продуктов перекисного окисления липидов [20, 21]. Экспериментально показано, что утрата Nrf2 сопровождается выраженным снижением конститутивной и индуцируемой экспрессии ряда печёночных GST-генов, в том числе представителей семейства Gstm [22]. Следовательно, анализ транскрипционной активности Gstp1, Gstt1 и Gstm может рассматриваться как информативный подход к оценке включения второй фазы детоксикации в печени. Генетические маркеры ферментов детоксикации также представляют интерес для оценки чувствительности к воздействию факторов водоподготовки и побочных продуктов обеззараживания [23].

Цель исследования — разработать специфичную тест-систему оценки прооксидантной активности токсикантов на основе метода анализа экспрессии генов печени крыс и продемонстрировать её возможности на примере определения порога хронического действия пероксида водорода при пероральном поступлении.

Материалы и методы. Экспериментальная работа была проведена на белых беспородных крысах-самках. Животные содержались в условиях вивария при свободном доступе к воде и стандартному корму. При проведении эксперимента соблюдались требования гуманного обращения с лабораторными животными и основные положения Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях.

Пероксид водорода вводили внутрижелудочно в течение 6 месяцев 5 раз в неделю. Контрольным животным вводили дистиллированную воду. Опытные животные получали растворы ПВ в дозах 0,05; 0,5; 5 и 50 мг/кг. Для молекулярно-генетического анализа использовали образцы печени 38 животных: контрольная группа — 6 особей, опытные группы — по 8 особей в каждой дозовой группе.

Образцы печени растирали в жидком азоте. Затем проводили выделение РНК с использованием реагента ExtractRNA («Евроген», Россия) согласно инструкции производителя. На полученной РНК синтезировали кДНК с помощью набора MMLV RT kit («Евроген», Россия). Анализ экспрессии генов NFE2L2, Gstp1, Gstt1 и Gstm, а также референсного гена Gapdh проводили методом количественной ОТ-ПЦР в режиме real-time на амплификаторе Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия) с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green. Уровень экспрессии мРНК исследуемых генов нормализовали относительно экспрессии Gapdh.

Для интегральной оценки активности GST-звена рассчитывали показатель GST-индекс как среднее арифметическое значений экспрессии Gstp1, Gstt1 и Gstm у каждого животного. Данный показатель использовали как суммарный индикатор включения генов второй фазы детоксикации.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием Python 3.13. Результаты представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (M±m). С учётом различий в численности групп и возможной неоднородности дисперсий для общей оценки межгрупповых различий применяли дисперсионный анализ Welch ANOVA. Сравнение опытных групп с контролем проводили с использованием t-критерия Welch с поправкой Холма на множественные сравнения. Дополнительно оценивали дозозависимый характер ответа и рассчитывали benchmark dose (BMD) для двукратного повышения GST-индекс. Пороговый уровень статистической значимости принимали равным p<0,05.

Результаты. Проведённый анализ показал, что хроническое воздействие ПВ сопровождалось выраженной дозозависимой перестройкой транскрипционной активности NFE2L2 и генов семейства глутатион-S-трансфераз. При этом характер ответа был неодинаковым в диапазоне низких, средних и высоких доз.

В контрольной группе уровень экспрессии NFE2L2 составил –0,64±0,37 относительных единиц. При воздействии 0,05 мг/кг среднее значение повышалось до 0,23±0,30, а при дозе 0,5 мг/кг — до 0,41±0,31. Данные изменения носили характер тенденции и после поправки на множественные сравнения не достигали уровня статистической значимости. При введении ПВ в дозе 5 мг/кг экспрессия NFE2L2 повышалась до 1,51±0,28 (p=0,0037 по сравнению с контролем), а при дозе 50 мг/кг — до 3,04±0,31 (p<0,001). Кроме того, уровень NFE2L2 в группе 50 мг/кг был значимо выше, чем при 5 мг/кг (p=0,0083), что свидетельствует о нарастании активности регуляторного звена по мере увеличения дозовой нагрузки (рис. 1).

Наиболее чёткий ступенчатый ответ был установлен для генов семейства GST. В диапазоне 0,05–0,5 мг/кг значения Gstp1, Gstt1 и Gstm практически не отличались от контроля. Так, экспрессия Gstp1 составила 1,02±0,06 и 0,97±0,05, Gstt1 — 1,03±0,09 и 0,95±0,07, Gstm — 1,02±0,07 и 1,01±0,07 относительных единиц при дозах 0,05 и 0,5 мг/кг соответственно. Все указанные изменения были статистически незначимыми.

При переходе к дозе 5 мг/кг наблюдалось синхронное повышение экспрессии всех исследованных GST-генов. Уровень Gstp1 достигал 1,97±0,07, Gstt1 — 2,04±0,12, Gstm — 2,31±0,14 относительных единиц. Различия с контролем были статистически значимыми для всех трех генов (p<0,001). При максимальной дозе 50 мг/кг экспрессия Gstp1 возрастала до 4,41±0,28, Gstt1 — до 4,19±0,17, Gstm — до 4,05±0,17 относительных единиц. При этом значения всех GST-генов в группе 50 мг/кг были достоверно выше, чем при дозе 5 мг/кг, что отражает дальнейшую мобилизацию детоксикационного звена (табл. 1, рис. 2).

Для суммарной характеристики GST-звена был рассчитан интегральный показатель GST-индекс. В контроле он составил 1,00±0,06. При дозах 0,05 и 0,5 мг/кг показатель оставался на уровне контроля и составлял 1,02±0,03 и 0,98±0,05 соответственно. При дозе 5 мг/кг GST-индекс возрастал до 2,11±0,06, а при дозе 50 мг/кг — до 4,22±0,08. Разница с контролем составила +1,10 относительных единиц для дозы 5 мг/кг и +3,21 относительных единиц для дозы 50 мг/кг; оба различия были высоко достоверными.

Дополнительная оценка по принципу benchmark dose показала, что расчётная BMD для двукратного увеличения GST-индекс составляет 4,06 мг/кг, нижняя доверительная граница BMDL — 2,65 мг/кг, верхняя граница BMDU — 5,52 мг/кг. Таким образом, расчётный порог интегральной GST-активации находится вблизи экспериментальной дозы 5 мг/кг (рис. 3, табл. 2).

Обсуждение. Настоящее исследование показало, что хроническое пероральное воздействие ПВ сопровождается нелинейным нарастанием всех молекулярных показателей, а формированием ступенчатого ответа печени. Наиболее важным является то, что в диапазоне 0,05–0,5 мг/кг экспрессия Gstp1, Gstt1 и Gstm сохранялась на уровне контрольных значений, тогда как при дозе 5 мг/кг происходило синхронное включение всех исследованных GST-генов. Это позволяет рассматривать указанную дозу как молекулярный порог адаптивной активации второй фазы детоксикации.

Полученный профиль хорошо согласуется с современными представлениями о Nrf2-зависимой регуляции антиоксидантного ответа. NFE2L2/Nrf2-система активируется при накоплении окислительных и электрофильных стимулов и обеспечивает транскрипционное включение генов, направленных на восстановление редокс-баланса [7–9, 15, 16]. В нашем эксперименте повышение NFE2L2 уже при 5 мг/кг сопровождалось увеличением транскрипционной активности Gstp1, Gstt1 и Gstm. Это указывает на согласованную работу регуляторного и эффекторного звеньев антиоксидантной защиты печени.

Отсутствие значимых изменений при 0,05 и 0,5 мг/кг, вероятно, отражает достаточность конститутивного пула антиоксидантных и детоксикационных ферментов для нейтрализации низкоинтенсивной пероксидной нагрузки. В этих условиях клетка не нуждается в запуске энергозатратной транскрипционной перестройки. Напротив, дозу 5 мг/кг следует рассматривать как уровень, при котором базальные резервы уже требуют усиления за счёт NFE2L2/GST-оси, но сам характер ответа остаётся организованным и компенсированным.

Особого внимания заслуживает GST-индекс. В отличие от анализа отдельных генов, он отражает интегральное состояние семейства GST и позволяет уменьшить влияние внутригрупповой вариабельности отдельных транскриптов. В нашем исследовании GST-индекс демонстрировал наиболее чёткий ступенчатый профиль: отсутствие изменений в области низких доз, двукратное повышение при 5 мг/кг и более чем четырёхкратное повышение при 50 мг/кг. Расчёт BMD для двукратного повышения GST‑индекс также указывает на близость расчётного порога к дозе 5 мг/кг. Следовательно, GST-индекс может быть использован как удобный суммарный показатель раннего молекулярного ответа печени на хроническое воздействие окислителя.

В группе 50 мг/кг выявлена выраженная гиперэкспрессия NFE2L2 и всех GST-генов. С одной стороны, это свидетельствует о сохранении способности гепатоцитов к мобилизации защитных программ. С другой стороны, столь высокий уровень транскрипционной активности может отражать уже предельное напряжение системы детоксикации. Поэтому результаты по максимальной дозе не следует трактовать как простое усиление физиологической адаптации. Более вероятно, что при 50 мг/кг NFE2L2/GST-ось работает в условиях тяжёлой окислительной нагрузки и не может рассматриваться изолированно от других маркеров клеточного повреждения.

Таким образом, на основе анализа полученных экспериментальных данных можно определить недействующую, пороговую и действующую дозы ПВ, которые равны 0,5, 5 и 50 мг/кг соответственно. Результаты полученные в настоящей работе хорошо согласуются с результатами, полученными ранее при проведении комплексной токсико-гигиенической оценки ПВ по «классической» программе, которая включает в себя оценку функционального состояния нервной системы, определение периферического состава крови, биохимических показателей сыворотки крови и мочи (активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы (ЛДГ), холинэстеразы, креатинфосфокиназы (КФК), панкреатической амилазы, альфа-амилазы (α-амилаза), уровней холестерина, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), фосфолипидов, общего билирубина, содержания глюкозы, общего белка, альбуминов, мочевины, креатинина), определение массовых коэффициентов внутренних органов [11]. В результате комплексного обследования животных через 6 месяцев экспозиции ПВ было установлено, что доза ПВ 50 мг/кг является действующей и вызывает снижение уровня содержания ЛПНП и фосфолипидов, гемоглобина, активности ЛДГ и КФК, доза ПВ 5 мг/кг — пороговой по снижению уровня содержания ЛПНП и фосфолипидов, которые могут рассматриваться как биомаркеры токсического действия ПВ, опосредованно связанных с окислительным стрессом, а доза 0,5 мг/кг оказалась недействующей.

Литературные данные по изучению субхронического и хронического перорального воздействия ПВ на организм лабораторных животных ограничены и установленные пороговые дозы находятся в диапазоне от 60 до 0,05 мг/кг [24]. В 100-дневном пероральном исследовании ПВ на крысах не наблюдалось токсических эффектов при дозах <30 мг/кг, хотя при дозе 60 мг/кг наблюдались значительные изменения в показателях гематокрита, содержания белка и активности каталазы [25]. В 90-дневном исследовании на основании дозозависимого снижения потребления корма и воды, а также гиперплазии слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, пороговая доза составила 37 мг/кг/день для самцов и самок [26]. При пероральном введении ПВ в течение 6 месяцев доза 5 мг/кг вызывала изменение активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы в желудке и двенадцатиперстной кишке, содержания в периферической крови эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, ретикулоцитов; активность каталазы печени была на уроне контрольных величин. Пороговая доза в этом исследовании установлена на уровне 0,05 мг/кг по изменению активности указанных ферментов [27]. Данное исследование не было включено в оценку безопасности косметической продукции из-за недостаточного количества документации [24].

Заключение. Воздействие прооксиданта на организм приводит к дозозависимой ступенчатой перестройке экспрессии NFE2L2 и генов глутатион-S-трансфераз в печени крыс, что позволяет использовать анализ экспрессии генов печени крыс в качестве специфичной тест-системы для оценки прооксидантной активности при гигиеническом нормировании химических соединений. В на примере ПВ показано, что диапазоне 0,05–0,5 мг/кг значимых изменений исследованных GST-генов не выявлено, что свидетельствует о сохранении базового редокс-гомеостаза и достаточности конститутивных механизмов защиты, что позволяет считать дозу 0,5 мг/кг недействующей. Доза 5 мг/кг характеризуется достоверной активацией NFE2L2, Gstp1, Gstt1 и Gstm, а также двукратным повышением интегрального GST-индекс. Этот уровень воздействия можно рассматривать как порог хронического действия. При дозе 50 мг/кг формируется выраженная гиперэкспрессия всех исследованных компонентов NFE2L2/GST-оси, что отражает предельную мобилизацию детоксикационного потенциала в условиях высокой окислительной нагрузки, что позволяет считать данную дозу действующей. Наиболее информативным суммарным показателем оказался GST‑индекс, расчётная BMD которого для двукратного повышения составила 4,06 мг/кг при BMDL 2,65 мг/кг, при этом расчётный порог интегральной GST-активации соответствует порогу хронического действия 5 мг/кг. Полученные результаты позволяют рассматривать NFE2L2/GST-ось как молекулярный индикатор для определения порога хронического воздействия прооксидантов на организм. Порог хронического действия, полученный с помощью разработанной специфической тест-системы, совпадает со значением, полученным при проведении комплексного токсико-гигиенического исследования.

¹ ГН 1.1.701-98. Гигиенические критерии для обоснования необходимости разработки ПДК и ОБУВ вредных веществ в воздухе рабочей зоны, атмосферном воздухе населённых мест, воде водных объектов. М.; 1998. https://clck.ru/3WCxpJ