Введение. Кадмий (Cd) признан канцерогеном 1-й группы Международным агентством по изучению рака (МАИР) и играет значимую роль в развитии онкологических и хронических заболеваний человека. Основные пути поступления включают пищу, питьевую воду, табачный дым и промышленные аэрозоли. Благодаря длительному биологическому периоду полувыведения (10–30 лет) кадмий накапливается в организме, преимущественно в печени, где связывается с металлотионеинами (МТ), кодируемыми генами Mt1, Mt2, Mt3 [1, 2]. Каждая изоформа металлотионеинов отличается тканевой специфичностью, аффинностью к различным металлам и особенностями регуляции экспрессии. Комплексный анализ всех трёх изоформ позволяет получить целостную картину реакции организма на токсическое воздействие и оценить влияние различных методов коррекции на отдельные звенья защитной системы [3]. Комплекс Cd-металлотионеин с одной стороны снижает концентрацию свободного Cd²⁺ и временно ограничивает его цитотоксичность в гепатоцитах, но с другой становится источником переноса кадмия в системный кровоток и последующего накопления в почечной коре. Таким образом, печень выполняет роль первичного барьера и основного места биотрансформации и перераспределения кадмия, а повреждение её паренхимы сопровождается не только нарушением собственных функций, но и увеличением нагрузки на почки и другие органы‑мишени [4, 5].

В печени кадмий вызывает морфофункциональные нарушения такие как жировая дистрофия, некроз, воспаление и фиброз [6, 7]. Ключевым механизмом кадмиевой гепатотоксичности считается оксидативный стресс. Кадмий усиливает образование активных форм кислорода, истощает антиоксидантную защиту и повреждает мембраны гепатоцитов, что приводит к хроническому воспалению и ремоделированию стромы. Экспериментальные работы показывают, что блокада антиоксидантной защиты усиливает токсический эффект кадмия в печени и почках, тогда как введение антиоксидантов частично предотвращает рост маркеров цитолиза и снижает степень морфологических повреждений, что подчёркивает ведущую роль оксидативного стресса [8, 9].

Хроническое воздействие Cd повышает риск неалкогольной жировой болезни печени, стеатогепатита и гепатоцеллюлярной карциномы за счёт оксидативного стресса, воспаления и эпигенетических изменений. Гепатотоксичность сочетается с нефротоксичностью, остеотоксичностью, иммунодепрессией и сердечно-сосудистыми нарушениями, что подчёркивает необходимость строгого контроля поступления кадмия в окружающую среду и на рабочих местах [10, 11].

В условиях хронической низкодозовой интоксикации кадмием немаловажное значение имеет поиск средств, способных уменьшать биодоступность металла и ограничить его повреждающее действие. В этом отношении перспективным представляется комбинация пектина с оксиметилурацилом. Этот подход объединяет два механизма защиты, в котором пектин действует как природный сорбент — он связывает ионы кадмия в желудочно-кишечном тракте, образуя нерастворимые комплексы, которые выводятся из организма, не попадая в кровоток. А оксиметилурацил (ОМУ) дополняет действие пектина за счёт своих антиоксидантных и гепатопротекторных свойств, уменьшая оксидативный стресс, стабилизируя клеточные мембраны и стимулируя восстановление повреждённых тканей [12–14].

Цель исследования — изучить влияние пектина на основе ОМУ на экспрессию генов металлотионеинов и гистологическую структуру печени у крыс при хронической кадмиевой интоксикации.

Материалы и методы. Исследование проведено на 60 аутбредных самках крыс массой 190–220 г в возрасте 10–12 недель, которые были равномерно распределены по весовому принципу на 5 групп: 1 контрольную и 4 экспериментальные (табл. 1).

Пектин на основе ОМУ во всех группах перорально вводили через 1 час после токсиканта. Введение раствора CdCl₂ осуществлялось зондом 5 раз в неделю. Эвтаназию животных проводили через 4 месяца от начала эксперимента методом декапитации.

Окисленный пектин был получен на кафедре физической химии и химической экологии Башкирского государственного университета под руководством профессора Ю. С. Зимина в рамках научного сотрудничества. В качестве исходного субстрата использовали яблочный пектин фирмы Fluka (Германия) со средней молекулярной массой 213 кДа ([η]=2,3 дл/г, 298±1 К, вода). Окисление водных растворов пектина проводили в стеклянном термостатируемом реакторе барботажного типа с использованием озон-кислородной смеси, получаемой на озонаторе. Контроль процесса осуществляли по изменению содержания карбоксильных групп, определяемому методом потенциометрического титрования на рН-метре «рН-150МИ». На основе полученного окисленного пектина и оксиметилурацила был синтезирован комплексный препарат, который в дальнейшем использовали в экспериментальных исследованиях при интоксикации хлоридом кадмия [15, 16].

При уходе за животными, питании и проведении экспериментов руководствовались ГОСТом 33215-20141¹, рекомендациями ВОЗ, Европейской конвенции по защите животных.

Для анализа экспрессии генов фрагменты печени сразу после декапитации и вскрытия замораживали в жидком азоте с реагентом ExtractRNA (ЗАО «Евроген»). Тотальную РНК изолировали по протоколу производителя с использованием тризола. Полученную РНК из печени каждой крысы подвергали обратной транскрипции с MMLV-обратной транскриптазой и праймерами олиго-dT (Евроген, Москва). Экспрессию генов оценивали методом реал-тайм ПЦР на Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) с SYBR Green (Евроген) и специфическими праймерами (синтез Евроген, конструирование в PrimerQuest Tool, IDT, США). Нормализация осуществлялась по гену Gapdh, относительную экспрессию рассчитывали методом ΔΔCt, fold change (FC) = 2(–ΔΔCt) [17].

Для гистологического анализа печень фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, затем проводили дегидратацию и парафинирование. Из полученных парафиновых блоков на ротационном микротоме Leica RM 2125 RTS (Leica Biosystems, Германия) получали срезы толщиной 5–7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином. Микропрепараты исследовали с помощью имиджинговой системы Celena X (Logos Biosystems, Республика Корея) при увеличениях ×200 и ×400.

Статистическую обработку данных осуществляли в программе IBM SPSS Statistics 21 (IBM Corporation, США). Нормальность распределения проверяли тестом Колмогорова–Смирнова. Значимость межгрупповых различий оценивали с помощью однофакторного анализа дисперсии (ANOVA) с последующими апостериорными критериями Тьюки и Тамхейна. Результаты представлены в виде средней арифметической и стандартной ошибки (M±m). Уровень статистической значимости составил p<0,05.

Результаты. Экспрессия гена Mt1 в печени демонстрировала выраженную зависимость от применения пектина на основе ОМУ. Наибольший уровень экспрессии отмечен в группе положительного контроля (0,2±0,34 отн. ед.), однако различие с интактной группой не достигло статистической значимости (p=2,764).

Во всех группах, получавших пектин на основе ОМУ, наблюдалось достоверное снижение экспрессии Mt1 по сравнению с группой положительного контроля: группа 3 (–1,6±0,57; p=0,044), группа 4 (–1,49±0,29; p=0,002) и группа 5 (–1,36±0,41; p=0,028). При этом между группами, получавшими пектин на основе ОМУ по разным схемам, значимых различий не выявлено (p>0,05).

Полученные данные свидетельствуют о способности пектина на основе ОМУ подавлять экспрессию гена Mt1 независимо от времени его назначения относительно кадмиевой нагрузки. Результаты визуализированы на рисунке 1.

Экспрессия гена Mt2 в печени была достоверно снижена во всех группах, получавших пектин на основе ОМУ, вне зависимости от схемы его введения (рис. 2). В группе отрицательного контроля уровень экспрессии Mt2 соответствовал базальной активности (0,00±0,29 отн. ед.). В группе 2 наблюдалось умеренное снижение показателя до –0,39±0,48 отн. ед., однако разница с отрицательным контролем не была статистически значимой (p=0,959), что свидетельствует о слабой индукции гена в ответ на хроническую интоксикацию.

Во всех группах с применением пектина на основе ОМУ экспрессия Mt2 была значимо подавлена. Наибольшее снижение зафиксировано в группе 3 (–2,59±0,57 отн. ед.), что достоверно отличалось как от отрицательного (p<0,001), так и от положительного контроля (p=0,015). Схожая картина наблюдалась в группе 4 (–2,02±0,21 отн. ед.; p<0,001 и p=0,011) и 5 (–2,45±0,35 отн. ед.; p<0,001 и p=0,004 относительно контроля и группы 2, соответственно). Попарное сравнение между группами 3 и 4 не выявило статистически значимых различий (p>0,05), что указывает на сходное подавляющее влияние пектина на основе ОМУ на экспрессию гена Mt2 независимо от длительности применения. Графическое представление данных приведено на рисунке 2.

Экспрессия гена Mt3 в печени демонстрировала тенденцию к снижению под воздействием кадмия и значительную стимуляцию при терапии пектином на основе ОМУ, причём максимальный эффект наблюдался при длительном курсе коррекции, включающем восстановительный этап.

В группе отрицательного контроля уровень экспрессии гена Mt3 составил 0,00±0,29 отн. ед. В группе положительного контроля показатель снизился до –0,78±0,47 отн. ед., но разница с интактной группой не достигла статистической значимости (p=0,622), что подтверждает предположение о недостаточной активации транскрипции гена Mt3 при изолированном воздействии кадмия. Терапия пектином на основе ОМУ оказала корригирующий эффект. В группе 3 экспрессия возросла до 0,99±0,38 отн. ед., что значимо превышало показатель группы положительного контроля (p=0,033). В группе 5 уровень экспрессии составил 1,13±0,45 отн. ед., также отличаясь от группы, получавшей хлорид кадмия без коррекции (p=0,030). Наибольшая индукция гена зафиксирована в группе 4 (1,32±0,39 отн. ед.), где показатель был значимо выше не только от группы положительного (p=0,005), но и от группы отрицательного контроля (p=0,043). Этот результат подчёркивает важную роль длительного курса пектина на основе ОМУ в восстановлении функций металлотионеинов. Динамика изменений представлена на рисунке 3.

При микроскопическом исследовании в печени крыс контрольной группы сохранялась нормальная дольковая архитектоника. От центральных вен радиально отходили печёночные балки, синусоидные капилляры имели свободные просветы, гепатоциты отличались сохранной структурой без признаков дистрофии, некроза, воспаления или фиброза. Портальные тракты были без расширения и воспалительной инфильтрации, структура сосудов и междольковых желчных протоков соответствовала морфологии печени здоровых животных.

В группе животных, получавших кадмий, общая дольковая организация печени сохранялась, однако регистрировался комплекс патологических изменений. Отмечались очаговая воспалительная инфильтрация лимфоидными и гистиоцитарными клетками, полнокровие и расширение синусоидных капилляров с агрегатами эритроцитов, а также единичные участки фиброза преимущественно вокруг портальных трактов и центральных вен. В отдельных зонах выявлялись безъядерные некротизированные гепатоциты.

У группы крыс, получавших пектин на основе ОМУ на фоне кадмиевой нагрузки, сохранялась дольковая архитектоника печени при отсутствии выраженного полнокровия и массивных агрегатов эритроцитов в синусоидах. Отмечались гиперплазия клеток Купфера и умеренное повышение клеточности синусоидов, немногочисленные очаги воспалительной инфильтрации и единичные некротические гепатоциты, а также умеренное утолщение стенок междольковых вен.

У группы крыс, получавших пектин на основе ОМУ в период восстановления после кадмиевой интоксикации, морфологическая картина печени в целом соответствовала физиологической норме. Дольковая архитектоника сохранена, синусоидные капилляры имели свободные просветы без признаков выраженного полнокровия и стаза, сосуды портальных трактов и желчные протоки не демонстрировали склеротических или пролиферативных изменений. Отмечались только единичные, небольшие по площади и слабо выраженные очаги воспалительной инфильтрации в перипортальных зонах.

У крыс, получавших пектин на основе ОМУ как в период введения кадмия, так и в период восстановления, дольковая структура печени была сохранена, регистрировались лишь остаточные изменения в виде очаговых скоплений эритроцитов в просветах синусоидных капилляров и небольших участков клеточной инфильтрации, а также единичные некротизированные гепатоциты в перипортальных зонах.

Сравнительные данные гистологических изменений в печени крыс представлены в таблице 2.

Обсуждение. Во всех группах с пектином на основе ОМУ наблюдалось выраженное снижение экспрессии гена Mt2 (–2,59±0,57 отн. ед. в группе 3; p<0,001 по сравнению с группами положительного и отрицательного контроля).

Это можно объяснить тем, что пектин на основе ОМУ, связывая кадмий в кишечнике, уменьшал его всасывание в кровь. В результате снижалась нагрузка кадмием на печень, а вместе с ней уменьшалась потребность в синтезе металлотионеинов Mt1 и Mt2 как маркеров острого токсического повреждения. Это подтверждается значительным снижением степени повреждения печени и полным отсутствием фиброза [18, 19].

Экспрессия гена Mt3 изменялась в противоположном направлении. В группе 2 она снижалась до –0,78±0,47 отн. ед., а в группе 4 транскрипционная активность значительно возрастала до 1,32±0,39 отн. ед. (p=0,043 по сравнению с группой 2, p=0,005 по сравнению с группой контроля).

Причина может заключаться в том, что ген Mt3 отвечает за поддержание баланса цинка в клетках и антиоксидантную защиту, а не за детоксикацию кадмия. Длительное применение пектина на основе ОМУ в течение 4 месяцев восстановило запасы цинка в печени, что активировало экспрессию Mt3 и ускорило регенерацию тканей. Об этом свидетельствует минимальная степень повреждения печени при полном отсутствии полнокровия синусоидов. Такой сдвиг в профиле экспрессии генов металлотионеинов может указывать на переход печени от состояния токсического стресса к фазе восстановления [20–22].

Гистологические данные подтверждают результаты молекулярного-генетического анализа. В группе положительного контроля наблюдались типичные признаки токсического повреждения в виде большого количества воспалительных очагов, выраженного полнокровия синусоидов и начального фиброза вокруг портальных трактов. Это соответствует литературным данным о развитии перекисного окисления липидов и активации провоспалительных цитокинов под действием кадмия [23–25].

При совместном введении пектина на основе ОМУ с кадмием эти изменения значительно уменьшились, а именно количество воспалительных очагов сократилось, полнокровие почти исчезло, а фиброз не развивался. Такое улучшение можно объяснить сорбционным действием пектина на основе ОМУ в кишечнике, которое снижало поступление кадмия в кровь и уменьшало его накопление в печени.

Особенно показателен эффект длительной пектинотерапии на основе ОМУ, где морфология печени практически не отличалась от контроля. Воспалительные изменения были минимальными, синусоиды оставались свободными от полнокровия, дольковая архитектоника сохранялась. Это демонстрирует способность пектина не только ограничивать остроту токсического повреждения, но и ускорять процессы регенерации печени [13, 14].

Заключение. Пектин на основе ОМУ при хронической кадмиевой интоксикации корректировал экспрессию генов металлотионеинов Mt1, Mt2, Mt3, способствовал снижению воспалительных и фиброзных изменений в печени крыс. Продолжение терапии пектином в период ремиссии улучшало гистологическую структуру органа. Результаты свидетельствуют о потенциале пектина на основе ОМУ как дополнительного средства профилактики и коррекции при кадмиевых интоксикациях, что требует подтверждения в дальнейших исследованиях.

¹ ГОСТ 33215-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур. https://clck.ru/3TCHoF