Введение. Исследование влияния здоровья отцов на развитие потомства приобретает особую актуальность, что обусловлено недооценённой распространённостью нарушений репродуктивной функции, которая зачастую коррелирует со снижением фертильности. Разработка методов идентификации биомаркеров, способных прогнозировать неблагоприятный исход для потомства, является значимой задачей профилактической медицины и профпатологии. Множество экзогенных и эндогенных факторов, воздействующих на репродуктивный потенциал мужчин, оказывают влияние на постнатальное развитие их детей. Эти эффекты могут проявляться нарушением физического развития, нейроэндокринной регуляции и поведенческого статуса, так как именно ранние этапы онтогенеза являются критическими для установления взаимоотношений организма с окружающей средой, формирования адаптивных связей и закладки основ поведенческой активности [1–4].

Воздействие дыма природных пожаров поднимает вопрос о включении пожарных, работников лесопожарных станций, Авиалесоохраны, сотрудников МЧС и Минобороны России, государственных инспекторов ООПТ в группу профессионального риска нарушений здоровья. Ежегодно в РФ для тушения природных пожаров привлекается более 60,0 тыс. человек, подавляющее большинство (около 92%) из них — мужчины, причём 74% из них находятся в репродуктивном возрасте (20–49 лет). В зоне многокомпонентного задымления содержатся ультрадисперсные частицы, формальдегид, двуокись углерода (CO2), бензпирен, окись углерода (CO), оксиды азота, углеводороды и многие др. Контролирующими органами обычно определяется содержание в дыме природных пожаров твёрдых частиц РМ2,5 (ультрадисперсные твёрдые частицы диаметром 2,5 мкм) и СО, средние концентрации которых составляют соответственно 0,51 мг/м³ и 42–80 мг/м³. Учитывая режим работы пожарных в течение 10-14 часов, часто непрерывно 12–14 дней, а также нередко игнорирование средств защиты органов дыхания, воздействие неблагоприятных факторов многократно превышает безопасные уровни.

В системе охраны труда пожарных традиционно основное внимание уделяется травмам, ожогам и острым интоксикациям. На данный момент большинство исследований сосредоточено на основных, ответных реакциях со стороны различных физиологических систем, в то время как влияние дыма природных пожаров на потомство и его развитие остаётся малоизученным. Вместе с тем имеются литературные данные о нарушении репродуктивной функции пожарных. Показано нарушение сперматограммы по изменению объёма, количества, подвижности и морфологии сперматоцитов ниже референсных значений ВОЗ [5, 6], повышение частоты выявления рака яичка (SRE=2.02, что вдвое выше, чем в среднем) и рака простаты [7, 8], диагностики бесплодия [9].

Цель исследования — оценка влияния дыма торфяного пожара на постнатальное развитие потомства экспонированных самцов.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования проводились на базе вивария ФГБНУ «Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований» с использованием белых половозрелых крыс линии Вистар массой 180–230 г. Животные содержатся в специальном помещении с 12 часовым светлым/тёмным циклом, регулируемой температурой (22±3°C) и влажностью 60%, со свободным доступом к чистой водопроводной воде и пище, включающей в себя все необходимые витамины и микроэлементы (полнорационный гранулированный корм Дельта Фидс (АО «БиоПро», Россия). Все экспериментальные животные получены путём собственного воспроизводства в виварии ФГБНУ ВСИМЭИ (Заключение ОГБУ «Ангарская станция по борьбе с болезнями животных» от 21.04.2023 г.). Работа выполнена с соблюдением правил гуманного отношения к животным в соответствии с Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации о гуманном отношении к животным (редакция — октябрь 2008 г.), Европейской Конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.), а также «Правил лабораторной практики» (приказ Минздравсоцразвития от 23.08.2010 г. № 708н). При планировании исследования получено заключение локального этического комитета ФГБНУ ВСИМЭИ, подтверждающее соблюдение этических норм при обращении с животными (протокол № 7 от 15 декабря 2023 г.).

В качестве тест-системы были использованы крысы обоих полов (возраст 12–16 недель; 20 самцов, 60 самок, 260 особей их потомства). В течение всего периода проведения эксперимента проводили ежедневный осмотр животных с целью выявления признаков интоксикации и наблюдение за развитием потомства. В каждом помёте регистрировали количество крысят, распределение по полу, выживаемость.

Самцов опытной группы (n=10) в 200 л ингаляционных камерах подвергали ингаляционному воздействию торфяного дыма по 4 часа в день в течение 5 дней. Целевой уровень задымления, контролируемый по содержанию ультрадисперсных частиц — РМ2,5 и СО, достигался путём разбавления дыма чистым воздухом [10] и составлял для СО — 21(13;28) мг/м³, для РМ2,5 — 0,09(0,04;0,19) мг/м³. Данные целевые показатели были выбраны нами на основании реальных инструментальных замеров, с которыми сталкиваются пожарные при борьбе с природными пожарами из литературных источников [11, 12]. Самцы контрольной группы (n=10) в эквивалентном режиме в ингаляционных камерах получали чистый воздух.

По окончании ингаляционного периода интактных самок подсаживали к самцам в соотношении 3:1 сроком на два эстральных цикла (14 дней). При спаривании с интактными самками крыс изменений полового поведения самцов крыс, экспонированных дымом, по сравнению с контрольными животными не наблюдали. Оплодотворение регистрировали с помощью вагинальных мазков по наличию сперматозоидов. Беременных самок сразу отсаживали и содержали по 5 особей в клетке до 17 дня беременности, а с 18 дня — в индивидуальных клетках. Помёты содержали с матерью до 21-го дня жизни. Ввиду затруднённой половой идентификации крысят (отсутствие вторичных половых признаков и неполная дифференцировка наружных гениталий) животные были распределены в группы без учёта пола. А далее по 6–7 особей в соответствии с полом.

Критериями репродуктивного благополучия служили фертильность родительских особей и жизнеспособность потомства. О последней судили по уровню постнатальной смертности, динамике прироста массы тела, скорости созревания основных морфологических признаков и сенсорно-двигательных рефлексов, мышечной силы и показателям поведения. Процент неонатальной смертности рассчитывали как отношение количества погибших крысят к общему количеству родившихся крысят в помёте. Регистрировали массу тела (на 4, 7, 14 и 21 день жизни), сроки отлипания ушной раковины, появления первого подшёрстка, прорезывания резцов и открывания глаз. При изучении сроков созревания сенсорно-двигательных рефлексов у новорождённых животных из каждого помёта случайным образом выбирали 4-х особей. Фиксировали сроки формирования следующих рефлексов: «отрицательный геотаксис», «избегание обрыва», «переворот в свободном падении» [13]. Мышечную силу определяли на 28-ой день жизни крысят (Р28). Двигательную активность крысят на 4-й и 7-й день жизни оценивали в арене 15×15 см, разделённой на квадраты 1×1 см, регистрировали количество квадратов, пересечённых передней лапой и поднимание головы в течение 30 секунд. На 14-й и 21-й день жизни использовали арену 30×30 см, разделённую на квадраты 5×5 см, регистрировали поведенческие акты (вертикальные стойки и стойки с упором, локомоции, груминг, обнюхивания, фризинг), наблюдение вели в течение 1 мин. В возрасте 40 дней жизни (P40) белых крыс (самцов и самок) тестировали в тесте «Открытое поле».

Для статистической обработки результатов исследования использовали пакет прикладных программ STATISTICA 6.1, Stat Soft Inc. (США). Для принятия решения о виде распределения признаков использовали W-критерий Шапиро–Уилка. Для сравнения независимых групп при ненормальном распределении признаков применяли U-критерий Манна–Уитни, при нормальном — t-критерий Стьюдента. При сравнении групп по частоте встречаемости признаков (созревание рефлексов, признаки физического созревания), статистическая обработка проведена по абсолютным частотам с использованием точного критерия Фишера для таблиц сопряжённости.

Результаты. Как показали проведённые исследования, ингаляционное воздействие торфяного дыма на крыс-самцов не оказывало негативного влияния на их способность к воспроизводству. Средняя плодовитость опытной и контрольной группы составляла соответственно 11,7±3 и 11,9±1,7 крысят в помёте, случаи мёртворождаемости не наблюдались. Однако в процессе наблюдения за живорождёнными потомками, обнаружено, что постнатальный этап их онтогенеза протекал с некоторыми неблагоприятными отклонениями. Несмотря на сопоставимый уровень фертильности самок, спаренных с экспонированными самцами, и контрольных особей, показатель смертности потомства к 21-му дню жизни в опытной группе статистически значимо превышал уровень контроля, составив 15% против с 5% в контроле (р=0,005). Средняя величина массы тела крысят от экспонированных торфяным дымом самцов с высоким уровнем значимости превышала показатели контрольной группы во все сроки обследования (p<0,003, табл. 1).

У крысят опытной группы фиксировали и другие признаки нарушения физического созревания по сравнению с потомками от не экспонированных дымом отцов. У опытного потомства отмечали запаздывание в сроках прорезывания нижних резцов. В контрольной группе они появились у всех особей на 10 постнатальный день, тогда как в опытной группе признак был положителен только у 74% животных (р<0,001). На 18-й день жизни открывание глаз также наблюдалось с отставанием у 5,5% животных по сравнению с контрольной группой (p=0,045). Сроки появления первичного волосяного покрова были синхронны у потомства опытной и контрольной групп (Р6). При оценке мышечной силы на 28-й день постнатального развития длительность удержания крысят опытной группы на сетке составила 43,75(40;47) с, что на 34% (р=0,012) ниже соответствующего показателя контрольной группы 66,75(52,5;67,5). С данным тестом не справилось 32% особей опытной группы, против 100% выполнения в контроле.

При изучении сенсорно-двигательных рефлексов новорождённых, необходимых для выживания после родов и адаптации к новым условиям среды было выявлено, что у крысят, отцы которых были экспонированы торфяным дымом, наблюдались более поздние сроки их созревания.  Рефлексы «отрицательный геотаксис», «избегание обрыва», «переворот в свободном падении» своевременно сформировались в контрольной группе на 7-, 8- и 17-й дни жизни у 100% особей. В опытной группе наблюдалось статистически значимое отставание созревания данных рефлексов у 48% (р<0,001), 12% (р=0,040) и 28% (р=0,0002) особей соответственно.

Анализ показателей поведения потомства в период грудного вскармливания показал, что крысята опытной группы на 4-й день жизни проявляли статистически значимо меньшую двигательную активность по сравнению с особями контрольной группы, оцениваемую по количеству пересечённых передней лапой квадратов (р=0,019; табл. 2).

На 14-й день жизни снижение локомоторной активности у крысят опытной группы сохранялось, однако изменения не достигали статистической значимости и носили характер тенденции (р=0,09; табл. 3). На завершающем этапе подсосного периода (Р21), когда крысята начинают переходить к самостоятельному питанию, по уровню тревожности, двигательной и исследовательской активности особи опытной и контрольной групп не имели статистически значимых отличий. В возрасте 40 дней жизни (P40) тестирование белых крыс в «открытом поле» выявило статистически значимые различия между опытной и контрольной группами. Так, самки опытной группы демонстрировали угнетение двигательной активности относительно показателя контрольной группы, о чём свидетельствовало снижение пройденного за период тестирования пути на 13% (р=0,019). Поведение самцов в свою очередь сопровождалось достоверным повышением количества вертикальных стоек на 42% (р=0,009), что может являться показателем большей исследовательской мотивации, а также может косвенно свидетельствовать о гиперактивации дофаминергической системы [14], однако требуются дополнительные исследования для подтверждения этого механизма.

Обсуждение. В последние десятилетия наблюдается возрастающий интерес к исследованию роли отца на здоровье будущих поколений. Неблагоприятные экологические свойства производственной и окружающей среды являются факторами риска для формирования нарушений развития и функционирования ЦНС потомства, которые могут проявляться уже в раннем детстве, а также в более позднем возрасте [15–17]. Исследования показывают, что окружающая среда может воздействовать на мужскую репродуктивную систему несколькими путями:

Возникающие в раннем постнатальном периоде сбои в созревании сенсорно-двигательных рефлексов на последующих этапах онтогенеза могут приводить к нарушению формирования нейронных контактов, проблем с выработкой новых навыков, отставленные во времени нейрофизиологические и поведенческие нарушения. Последствия постнатальной патологии могут сохраняться вплоть до подросткового возраста и далее, в частности, обусловленные эпигенетической модификацией генов [18–20].

Результаты проведённого исследования показали, что воздействие торфяного дыма на крыс-самцов имеет отдалённые неблагоприятные эффекты в виде нарушений развития новорождённого потомства, являясь предиктором постнатальных нарушений. В среднем, у потомства, отцы которых были экспонированы торфяным дымом, наблюдались одновременно в 50–71% случаев изменения изучаемых показателей и включали в себя следующие нарушения: тенденция к повышению постнатальной смертности; нарушение физического развития; отставание созревания сенсорно-двигательных рефлексов; снижение мышечной силы; стойкие изменения структуры видоспецифического поведения. Следует отметить, что угнетение двигательной активности самок и повышение числа вертикальных стоек в тесте открытое поле у самцов из потомства экспонированных дымом отцов, выявленное в 40-дневном возрасте, может свидетельствовать о развитии депрессивно-подобного состояния, обусловленного гиперактивностью дофаминергической системы.

Исследования позволили выявить и обосновать группу критериальных показателей (маркеров), позволяющих идентифицировать репродуктивную токсичность при воздействии дыма торфяного пожара: нарушение физического развития, набор массы тела, позднее прорезывание резцов; отставание созревания сенсорно-двигательных рефлексов; снижение мышечной силы; снижение двигательной активности и повышение уровня стрессированности.  По нашему мнению, в основе постнатальных нарушений у потомства крыс-самцов, экспонированных дымом, в основном лежат индуцированные продуктами горения эпигеномные модификации, хотя возможны и другие механизмы влияния на мужскую репродуктивную систему.

В проведённом эксперименте воздействие торфяного дыма находилось на уровнях реального натурного загрязнения в зоне дыхания пожарных во время тушения природных пожаров. В данных условиях зафиксированы изменения соматических показателей новорождённого потомства, которые сохранялись практически до полуторамесячного возраста крысят. Согласно гистолого-анатомическим данным [21, 22] при сравнении темпов развития мозга и нейрональных систем, мозг детёныша крысы в течение второй недели постнатального развития соотносится с мозгом доношенного новорождённого [23], а 1 день жизни раннего постнатального развития крысы примерно сопоставим с 52 днями жизни новорождённого. Транслируя результаты экспериментального исследования при сопоставлении сроков выявления физических и сенсорно-двигательных нарушений потомства крыс в раннем постнатальном периоде, мы, с большой долей вероятности, предполагаем возможность возникновения нарушений в развитии детей раннего возраста (примерно 1,5-2 года) у ликвидаторов природных пожаров следующего характера: задержка роста и набора веса, снижение физической выносливости, снижение мышечного тонуса или, наоборот, избыточный тонус, трудности с восприятием сенсорной информации, повышенная утомляемость, нарушение осанки, проблемы с мелкой моторикой. Последствия постнатальных нарушений могут долгосрочно закрепляться в онтогенезе и сохраняться вплоть до половой зрелости, отягощая процесс обучения и социальной интеграции, способствуя развитию повышенной тревожности и депрессивного состояния [24].

Вместе с тем, следует подчеркнуть, что на текущем этапе разработанная модель ориентирована на поиск и направлена на генерацию гипотез. Проведена лишь частичная (внутренняя, теоретическая) валидация, основанная на обосновании уровней экспозиции и согласованности выявленных нарушений постнатального развития с известными данными по репродуктивной и нейротоксичности продуктов горения.

Заключение. Следует подчеркнуть, что эффекты, выявленные в ходе биомоделирования, не следует рассматривать как точное отражение патологических состояний у человека. В данной статье была обозначена проблема отдалённых последствий воздействия дыма пожаров. Для оценки рисков необходимы дальнейшие клинические обследования детей пожарных — ликвидаторов природных пожаров, результаты которых подтвердят или опровергнут высказанную нами гипотезу. Поскольку снижение фертильности у мужчин становится всё более распространённым явлением, проведённые исследования, изучающие влияние отцовского фактора на здоровье будущих детей, имеют существенное практическое значение, что следует учитывать для оптимизации применения репродуктивных технологий в клинической практике.