Введение. Проблема токсического действия тяжёлых металлов, попадающих в организм различными путями, в том числе при вдыхании, остаётся актуальной [1]. Менее изученным вопросом остаётся токсические эффекты наночастиц тяжёлых металлов и их оксидов, в частности наночастиц оксида свинца (НЧ PbO), образующихся как побочный продукт технологического процесса на промышленном производстве, например при высокотемпературных процессах, таких как плавка и сварка [2].

Современные данные указывают на то, что токсическое действие НЧ PbO отличается большей выраженностью по сравнению с частицами крупного размера, что может быть связано со значительной удельной поверхностью, повышенной проникающей и реакционной способностью [3]. Токсическое действие НЧ PbO имеет схожие механизмы с микрочастицами, органическими и неорганическими солями свинца и характеризуется разобщением процессов образования активных форм кислорода (АФК) и их нейтрализации естественными антиоксидантными системами (окислительный стресс), а также ионной мимикрией [4]. При этом внутриклеточное растворение НЧ PbO определяет их выраженное цитотоксическое действие.

Известно, что интоксикация свинцом является значимым фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Так, воздействие свинца было связано с повышением артериального давления, нарушениями сердечной проводимости, такими как внутрижелудочковая и атриовентрикулярная блокада, а также повышенным риском развития сердечной недостаточности [5]. Однако вопрос кардиотоксического действия НЧ PbO остаётся не вполне изученным. Особенности кардиотоксического действия НЧ PbO в зависимости от пути и продолжительности введения, определяющих характер токсикокинетики и биорастворения, требуют дальнейшего изучения.

Цель исследования — оценить изменения ряда клинических, функциональных и метаболомных показателей, характеризующих состояние сердечно-сосудистой системы, при ингаляционном воздействии НЧ PbO в течение 4 месяцев.

Материалы и методы. Эксперимент на животных.  Эксперимент проводился на аутбредных крысах-самках массой 321,47±3,85 г (разброс по массе не превышал 10%), которых случайным образом разделили на контрольную группу и основную, подверженную ингаляционному воздействию НЧ PbO. На момент начала эксперимента возраст животных составлял 12–14 недель. Каждая группа насчитывала по 10 животных, которых содержали в соответствии с требованиями ГОСТ 34088-2017¹. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора (протокол № 4 от 12.06.2022 г.).

Экспозиция НЧ PbO в концентрации 0,2 мг/м³ осуществлялась с помощью ингаляционной установки по типу «только нос» (CH Technologies, USA) в течение 4 часов в день 5 раз в неделю на протяжении 4 месяцев. Получение и способ введения НЧ был описан ранее [6]. Средний размер НЧ по данным сканирующей электронной микроскопии составил 18,2±4,2 нм.

Животных выводили из эксперимента путём быстрой декапитации, проводили аутопсию. Оценивали массовые показатели сердца (абсолютная и относительная масса). Определяли концентрацию копропорфирина и дельта-аминолевулиновой кислоты в разовой порции мочи, как индикаторов свинцовой интоксикации.

Гистологическое исследование. Для гистологического исследования ткани сердца фиксировали, обезвоживали и парафинизировали, а затем подготавливали ультратонкие срезы (3–4 мкм). Препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, исследовали с помощью светового микроскопа Axio Lab.A1 и камеры Axiocam 208 color (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия) при увеличении ×100, ×200, ×400².

Электрокардиографическое исследование и измерение артериального давления. По завершению эксперимента у крыс неинвазивно регистрировали электрокардиограмму, артериальное давление (АД) (систолическое, диастолическое, среднее, пульсовое) и частоту сердечных сокращений (ЧСС), скорость кровотока и объём крови в хвосте с помощью приборов ecgTUNNEL (emka TECHNOLOGIES, Париж, Франция) и CODA-HT8 (Kent Scientific, Торрингтон, США).

Метаболомное исследование. Пробоподготовку и хроматомасс-спектрометрический анализ ткани сердца проводили согласно [7]. Дополнительно на этапе пробоподготовки для экстракции полярных метаболитов использовали смесь метанол/вода (1:1) по тому же протоколу. Для хроматографического разделения полярной фракции метаболитов использовали колонку ZORBAX HILIC Plus 2,1×100 мм (3,5 мкм).

Статистическая обработка. Критический уровень значимости был принят на уровне p≤0,05. Распределение было отличным от нормального (критерий Шапиро–Уилка), результаты представлены как медиана, 25-й – 75-й квартиль — Ме (Q1–Q3). Различия между выборками оценивали с помощью критерия Манна–Уитни. Анализ выполняли в среде программирования Python (3.9.12), библиотека SciPy (1.7.3).

Результаты. Исследование предполагало оценку кардиотоксических эффектов НЧ PbO при ингаляционной экспозиции лабораторных животных (крыс). Аутопсическое исследование, выполнявшееся на этапе выведения лабораторных животных из эксперимента, показало, что группы не различались по начальному и конечному весу, приросту массы тела, абсолютной и относительной массе сердца.

Выполнено определение концентрации копропорфирина и дельта-аминолевулиновой кислоты в моче в качестве показателей свинцовой интоксикации. Установлено, что уровень копропорфирина в основной группе (85,00 (58,65–96,90)) по сравнению с контрольной (51,00 (45,05–57,80)) был значительно повышен (p=0,003), что объясняется большей чувствительностью данного показателя при длительном слабовыраженном воздействии [8].

Выполнено гистологическое исследование тканей сердца (табл. 1). Отмечалось увеличение диаметра кардиомиоцитов левого желудочка (КМЦ ЛЖ) и правого желудочка (ПЖ). Очагово определялся извитой ход кардиомиоцитов, увеличение межклеточных промежутков за счёт отёка. Трёхслойная архитектоника была сохранена. Кардиомиоциты миокарда предсердий увеличенного размера относительно контроля, сосуды полнокровны, васкуляризация обильная.

Анализ показателей системной гемодинамики (табл. 2), показал статистически значимое различие величины пульсового давления между исследованными группами. Отличий по другим показателям не наблюдалось.

Результаты электрокардиографического исследования лабораторных животных основной и контрольной групп представлены в таблице 3. В первом отведении было установлено значимое укорочение интервала QT в основной группе. Во втором отведении наблюдалось сокращение комплекса QRS в группе животных, подвергшихся воздействию НЧ PbO.

В результате проведённого метаболомного анализа ткани сердца животных были обнаружены изменения в уровне содержания 9 метаболитов, которые касались ряда метаболических путей: метаболизм аргинина и пролина, пуриновый обмен, метаболизм метионина, жирных кислот, лизофосфатидилхолинов (LPC) и лизофосфатидилэтаноламинов (LPE). Так, было выявлено увеличение уровня пролина в 1,3 раза (p=0,019), аденина в 1,2 раза (p=0,010), сульфоксид метионина в 1,8 раза (p=0,038), сукциниладенозина в 1,4 раза (p=0,019), линолевой кислоты в 1,5 раза (p=0,010), LPE 18:0 в 1,3 раза (p=0,010), LPE 18:1 в 3,1 раза (p=0,038), LPC 18:1 в 1,3 раза (p=0,038) и LPC 18:2 в 1,3 раза (p=0,038).

Обсуждение. Экспериментальная модель ингаляционного введения в течение 4 месяцев НЧ PbO позволила выявить токсические эффекты на сердечно-сосудистую систему лабораторных животных, в частности увеличение пульсового давления. Представлено множество данных, указывавших на увеличение АД при свинцовой интоксикации. Так, введение крысам внутримышечно ацетата свинца в течение 30 дней привело к значимому увеличению значения систолического и диастолического артериального давления [9]. Повышение систолического АД при хронической свинцовой интоксикации было ассоциировано со снижением биодоступности оксида азота — сильного вазодилататора, определяющего величину периферического сопротивления [10].

В качестве основных механизмов повышения АД при интоксикации свинцом выделяют следующие. Во-первых, свинец, ингибируя активность антиокислительных ферментов по причине высокого сродства к сульфгидрильным (–SH) группам, косвенно способствует увеличению патологического действия АФК, которые, в свою очередь, вступают в реакцию с оксидом азота, разрушающимся с образованием пероксинитритов, обладающих мощным вазоконстрикторным и цитотоксическим действием [11, 12]. Во-вторых, свинцовая интоксикация была ассоциирована с усилением высвобождения ренина, гиперпродукцией альдостерона и увеличением активности ангиотензинпревращающего фермента, что прямо определяет величину АД [13]. Проведённое исследование показало, что хроническое воздействие НЧ PbO вызывает увеличение пульсового давления. Это согласуется с данными клинического исследования, в котором лица с более высоким содержанием свинца в костях по данным рентгенофлуоресцентной спектрометрии отличались значительным увеличением пульсового давления [14].

Зафиксированы изменения параметров сократительной функции сердца в группе, экспонированной с НЧ PbO, а именно сокращение интервала QT в первом отведении и комплекса QRS — во втором. По существующим представлениям механизм нарушений электрокардиографической проводимости при свинцовой интоксикации заключается в том, что ионы свинца, обладая определённым физико-химическим сходством с ионами кальция, блокирует кальциевые каналы Cav 1.2, замедляя ток ионов, что ведёт к увеличению продолжительности фазы плато, проявляющейся пролонгацией интервалов [15]. Модель свинцовой интоксикации с ацетатом свинца в дозе 50 мг/кг массы тела в течение 4 недель позволила выявить значительную пролонгацию комплекса внутрижелудочковой проводимости QRS во втором отведении [16]. Одно из предшествующих экспериментальных исследований показало сокращение ширины комплекса QRS при ингаляционном воздействии НЧ PbO в течение 5 дней на лабораторных животных (крыс) [6]. Ранее была установлена пролонгация интервала QT, расширение комплекса QRS, а также увеличение амплитуды зубца Т на модели субхронического внутрибрюшинного введения крысам НЧ PbO в виде суспензии [17].

Механизм сокращения интервала QT и комплекса QRS в условиях ингаляционного воздействия НЧ PbO требует уточнения. Моделирование работы кальциевых каналов in silico показало, что при высокой концентрации ионов свинца может наблюдаться сокращение потенциала действия, как и при синдроме короткого интервала QT [18–19]. Другим возможным объяснением может быть ускоренная реполяризация вследствие нарушения работы калиевых каналов при замещении магния ионами свинца [20]. Таким образом, хроническая интоксикация НЧ PbO оказывает проаритмогенное воздействие.

Описанные выше нарушения гемодинамики и сократительной функции сердца при воздействии НЧ PbO обуславливают развитие органических изменений тканей сердца: установлено увеличение толщины КМЦ ЛЖ и ПЖ, что согласуется с литературными данными [21]. Ранее мы описывали атрофические изменения кардиомиоцитов ЛЖ и ПЖ при внутрибрюшинном введении НЧ PbO в течение 3 месяцев [17].

Проведённое метаболомное исследование позволило выявить метаболическую перестройку в ткани сердца животных. Так, изменения в метаболизме глицерофосфолипидов, выраженные в увеличении продуктов деградации фосфолипидов клеточных мембран (LPC, LPE и линолевая кислота), вероятно, являются следствием ПОЛ, связанного с образованием АФК при воздействии НЧ PbO [22]. При этом сообщалось, что накопление LPC в сердце способствует развитию сердечных аритмий и приводит к сердечной дисфункции [23]. Другим маркером окислительной нагрузки служит сульфоксид метионина, образующийся в процессе окисления метионина АФК [24].

В ответ на повреждения кардиомиоциты и эндотелиальные клетки способны активировать механизмы восстановления путём высвобождения адениновых нуклеотидов, АТФ и АДФ, которые распадаются до аденозина через АМФ, способствуя тем самым ослаблению повреждений через аденозиновую сигнализацию [25]. Наблюдаемое увеличение уровня сукциниладенозина и аденина, являющихся субстратами для синтеза адениновых нуклеотидов, может указывать на активацию адаптационных механизмов в сердце животных в ответ на воздействие НЧ PbO. Помимо этого, изменения в пуриновом обмене могут также негативно сказаться на энергетическом метаболизме и синтезе нуклеиновых кислот, так как АТФ служит основным источником энергии для многих биохимических процессов и является предшественником ДНК и РНК [26]. Путь катаболизма пролина также участвует в поддержании уровня АТФ и окислительно-восстановительного гомеостаза в кардиомиоцитах [27]. Накопление пролина в ткани сердца может указывать на дисфункцию данного метаболического пути в условиях воздействия НЧ PbO.

Заключение. Выполненное исследование позволило установить некоторые эффекты токсичности НЧ PbO на сердечно-сосудистую систему при хроническом ингаляционном воздействии в течение 4 месяцев. Отмечалось повышение величины пульсового давления. Выявлены изменения электрокардиографической проводимости сердца. Гистологически определялось увеличение размеров кардиомиоцитов. Метаболическая перестройка в сердце животных дополняет описанные структурные, электрофизиологические и гемодинамические изменения, демонстрируя вовлечённость окислительно-восстановительного и энергетического гомеостаза кардиомиоцитов в ответ на воздействие НЧ PbO. Полученные данные позволяют сделать вывод о кардиоваскулярной токсичности НЧ PbO при хроническом ингаляционном воздействии.

¹ ГОСТ 34088-2017. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за сельскохозяйственными животными. М., 2019. https://clck.ru/3TrMwG

² Методические рекомендации № 2939-83. К применению морфологических исследований при экспериментальном обосновании гигиенических нормативов вредных веществ в воздухе рабочей зоны : утверждены и введены в действие Приказом Заместителя Главного Государственного санитарного врача СССР А.И. Заиченко от 22 ноября 1983 г. № 2939-83 : введен впервые : дата введения 1983-11-22. Разработан под руководством профессора Н.Н. Литвинова коллективом авторов. Москва : Типография ВЦИО, 1983. Текст : непосредственный.