Введение. Длительное интенсивное вибрационное воздействие является хроническим стрессорным фактором для животных и человека, который вызывает нарушения как на нейрогуморальном, так и на молекулярно-клеточном уровнях, обусловливая патологические процессы в органах и тканях [1–3]. Показано, что производственная вибрация влияет на функционирование различных отделов как центральной нервной системы (ЦНС), так и периферической, что приводит к развитию профессиональной полинейропатии [4–6].

Экспериментальными исследованиями на животных установлено, что продолжительная вибрация оказывает негативное влияние на нейроны коры головного мозга и, как следствие, на состояние биоэлектрической активности головного мозга и поведенческие реакции крыс [4]. Однако малоизвестно о взаимосвязи показателей болевой чувствительности с морфологическими изменениями структуры нервной ткани крыс в динамике интермиттирующего вибрационного воздействия.

Цель исследования — изучить особенности изменения морфофункционального состояния нервной системы у крыс в динамике интермиттирующего вибрационного воздействия.

Материалы и методы. Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Wistar (n=59) с массой 160–240 г, полученных из ЦКП «Виварий конвенциональных животных» ИЦиГ СО РАН. Содержание, кормление и выведение животных из эксперимента проводили в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных или в иных научных целях (ETS № 123, European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes, Strasbourg, 18.03.1986). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний» (протокол заседания № 4 §2 от 18.11.2021 г.).

Крысы были разделены на 2 группы — контрольную и опытную. Группы формировали методом случайных чисел с использованием массы тела в качестве ведущего признака. На опытную группу крыс воздействовали вибрацией на основной частоте 16 Гц, по виброускорению 120 дБ. Вибрационное воздействие проводили в интермиттирующем режиме, состоящем из чередования восьми 20-минутных периодов вибрации и восьми 10-минутных перерывов в течение 4 часов в сутки 5 раз в неделю с общей продолжительностью эксперимента 9 недель [7]. Уровень вибрации измерялся с помощью анализатора шума и вибрации Ассистент БВЕК.438150-005РЭ (г. Москва). Выбранные уровни вибрации соответствовали реальному вибрационному воздействию в условиях производства. Группу контроля составили интактные животные, которые не подвергались вибрационному воздействию и содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище.

Изучение морфофункционального состояния нервной системы у крыс осуществляли с помощью физиологических и гистологических методов исследования.

Физиологические методы исследования представлены в таблице 1. С помощью классических болевых моделей — «Горячая пластина» («Hot plate») и «Отдёргивание хвоста» («Tail flick») проводили оценку изменения порогов болевой реакции (ПБР) в динамике вибрационного воздействия у крыс контрольной и опытной групп [8]. Принимая во внимание тот факт, что болевые пороги у грызунов подвержены циркадным колебаниям, измерение ПБР проводили в одно и тоже время суток и при окружающей температуре между 20°C и 25°C.

С помощью стандартного теста горячей пластины «Hot plate» определяли уровень общей возбудимости экспериментальных животных. Процедуру проводили, нагревая пластину прибора (Hot plate, Ugo Basile, Италия) до температуры 55±0,4°C и фиксируя время появления болевого поведения животного. Величину ПБР измеряли в секундах по латентному периоду появления каждой из избавляющих реакций: облизывания (или отдёргивания) передней, задней лапки и прыжка. Длительность тестирования составляла не более 30 сек. Оценка ПБР с помощью этого теста используется для определения особенностей регуляции болевой чувствительности на уровне центральных структур мозга [9].

Изменение болевого порога у крыс оценивали с помощью стандартного анальгезиометрического теста «отдёргивание хвоста» — «Tail flick» с помощью прибора фирмы Ugo Basile (Италия). Этот прибор позволяет подавать сфокусированный пучок света (ИК-излучение) на хвост животного и фиксировать время появления болевой реакции — латентный период по отведению хвоста животного. Величину ПБР измеряли в секундах. Оценка ПБР с помощью теста «Tail flick» позволяет определить особенности регуляции болевой чувствительности на уровне сегментарных отделов спинного мозга [9, 10].

Гистологические исследования. Структурные изменения, развивающиеся в результате длительного вибрационного воздействия, оценивали по результатам морфологического исследования ткани мозга крыс. Фрагмент головного мозга (кора больших полушарий) после декапитации животных выдерживали в нейтральном 10–12% формалине до полной фиксации. После фиксации кусочки гистологического материала тщательно промывали, подвергали химической обработке с применением аппарата для гистологической проводки. Из полученного материала на санном микротоме делали срезы толщиной 3–7 микрон, которые окрашивали гематоксилин-эозином, а также пикрофуксином по методу Ван Гизона для выявления соединительной ткани [11, 12]. Микроскопирование и динамическую микрофотосъёмку гистологических препаратов мозга проводили с помощью микроскопа Olympus СX31 RBSF (Германия) при увеличении окуляра 10×18 и объектива 40 с водной и масляной иммерсией c использованием цифровой камеры Levenhuk C800.

Статистический анализ результатов эксперимента осуществляли с помощью программы «STATISTICA Base for Windows v.10 Russian». Для всех экспериментальных групп проверяли гипотезу на нормальность распределения по критерию Шапиро–Уилкса. Для сравнения независимых выборок использовался U-критерий Манна–Уитни. В качестве средневыборочной характеристики использовали медиану (Me), первый и третий квартили (Q1; Q3). Различия считали статистически значимыми при уровне p≤0,05.

Результаты. Все экспериментальные исследования проводили с учётом воспроизводимости. Обязательным условием было использование крыс одного возраста и массы, содержание их в одинаковых условиях, соблюдение стандартности методик, что позволило нам сопоставить результаты, полученные у животных опытной и контрольной групп.

Оценка порога болевой реакции в тестах «Hot plate» и «Tail flick» показала, что у контрольных крыс, не подвергавшихся вибрационному воздействию, ПБР значительно не изменялся на протяжении всего эксперимента (табл. 2).

Интермиттирующее вибрационное воздействие на крыс в течение 9 недель приводило к изменению ПБР — удлинению латентного периода (ЛП) ответа в тесте «Hot plate». Видно, что в динамике вибрационного воздействия с 3-й по 6-ю недели ЛП увеличивался на 41% и 46% соответственно, по сравнению с контролем.

Оценка изменения ПБР в динамике вибрационного воздействия в тесте «Tail flick» также выявила удлинение ЛП отдёргивания хвоста у крыс — на 3-й неделе на 32%, на 6-й — на 28% и на 9-й — на 65% по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, изучение ПБР в тестах «Hot plate» и «Tail flick» выявило, что длительное вибрационное воздействие приводит к увеличению порогов болевой чувствительности.

Гистологическое исследование показало, что в ткани мозга контрольных животных отмечено равномерное распределение нервных клеток. Нейроны одинакового размера округлой формы с нормальным равномерным распределением хроматина (рис. 1А).

Вибрационное воздействие в течение 3-х недель (рис. 1Б) приводило к неравномерному распределению части нервных клеток в ткани мозга. При этом были выявлены нейроны неодинакового размера округлой и угловатой формы с неравномерным распределением хроматина в части ядер. На отдельных участках препарата головного мозга встречались очаги повышенной клеточности глиальных элементов между нейронами и в 20–25% нейронов отмечались признаки перицеллюлярного отёка.

На 6-й неделе вибрационного воздействия гиперхромия ядер нейронов стала более выраженной (рис. 2А). Часть нейронов демонстрировала признаки гиперфункции, что может быть связано с активацией метаболических процессов в мозге в ответ на вибрационное воздействие. Нейроны более крупные и асимметричные, с неравномерным распределением хроматина в ядре. Кроме того, в нейронах усилились признаки дистрофии и в клетках наблюдались нерезко выраженные признаки вакуолизации цитоплазмы и грануляция цитоплазматической субстанции. В некоторых участках ткани мозга выявлено умеренное увеличение количества астроцитов, что является признаком астроцитарного глиоза, связанного с очагами повреждения нейронов. Более выраженными стали увеличение клеток и отёк глиальных структур, что является признаком реакции на хроническое воздействие механического стресса.

На 9-й неделе эксперимента (рис. 2Б) изменения в структуре клеток мозга стали более заметными — ядра нейронов более ярко окрашены, что указывает на увеличение активности метаболических процессов. На фоне изменений нейронов и сосудов отмечались признаки функциональной активности астроцитов, что выражалось в их гипертрофии. В отдельных участках ткани мозга наблюдался интенсивный глиоз, особенно в областях с повышенной клеточностью и в периваскулярных пространствах. Такое прогрессирование пролиферации глиальных клеток может быть связано с компенсаторной реакцией на клеточную гибель при вибрации.

В целом, выявленные изменения свидетельствуют об активации и усилении патологического процесса в ткани головного мозга крыс в динамике интермиттирующего вибрационного воздействия.

Обсуждение. В биологических и медицинских исследованиях моделирование различных видов воздействий на животных имеет главную задачу — последующий перенос экспериментальных данных на человека [13]. Поэтому важным является адекватное приближение изучаемой модели к производственным условиям. Гигиеническими исследованиями показано, что на угольных шахтах юга Кузбасса рабочие подвергаются преимущественно не монотонному воздействию вибрации, а интермиттирующему, при котором уровень вибрационного воздействия колеблется в зависимости от характера и режима технологического процесса, используемого оборудования и ряда других факторов [14]. Так, выявлены эквивалентные уровни вибрации для горнорабочих очистного забоя: для проходчика подземного при буровзрывном способе выемки угля — 119–121 дБ при ПДУ 112 дБ (превышение в среднем на 6–8 дБ), а при механизированном способе — 128–131 дБ при ПДУ 126 дБ (превышение на 2–5 дБ) [15]. В целом, превышение ПДУ локальной и общей вибрации в сочетании с дополнительным воздействием других вредных факторов производственной среды (пыль, шум, тяжесть трудового процесса, охлаждающий микроклимат) является условием развития профессиональной патологии — вибрационной болезни — у работающих в угольной промышленности. Предлагаемая модель, представленная в патенте А.Г. Жуковой и соавт. [7], соответствует реальному вибрационному воздействию в условиях производства и отвечает правилам постановки гигиенического эксперимента в медицине труда [14].

Сравнительный анализ изменения ПБР опытных и контрольных крыс показал, что интермиттирующее вибрационное воздействие в течение 9 недель приводило к увеличению латентного периода ответа на болевое воздействие в тесте «Hot plate» и особенно в тесте «Tail flick» (табл. 2). Известно, что восприятие, проведение и обработка болевых импульсов при термораздражении или при воздействии инфракрасного теплового стимула на хвост крысы обеспечиваются различными структурами на определённых уровнях организации нервной системы [8, 16, 17]. Полученные результаты в тесте «Hot plate» свидетельствуют, что длительная вибрация (на основной частоте 16 Гц, по виброускорению 120 дБ) у крыс замедляла болевой ответ, организованный на супраспинальном уровне центральной нервной системы. Тест «Tail flick» был разработан для точного измерения болевого порога при воздействии инфракрасного теплового стимула на хвост крысы. По литературным данным, латентный период реакции отдёргивания хвоста интерпретируют лишь как свойство чувствительности болевых рецепторов кожи хвоста, однако такое воздействие по своей природе имеет более сложный ответ со стороны как периферической нервной системы, так и ЦНС [9, 10]. В наших исследованиях пролонгированное удлинение болевого ответа в тесте «Tail flick» у крыс опытной группы, скорее всего, связано с общим снижением активности ЦНС, что подтверждается данными о снижении чувствительности к любым внешним воздействиям, в том числе и к тепловым при длительном вибрационном воздействии [18–20].

Результаты физиологических исследований подтверждаются патоморфологическими изменениями в головном мозге крыс, развивающимися в динамике интермиттирующего вибрационного воздействия (рис. 1, рис. 2). На 3-й неделе вибрации нарушения в структуре ткани мозга начинают только проявляться в виде неравномерного распределения нервных клеток и появления гиперхромных нейронов. На 6-й и 9-й неделях вибрационного воздействия наблюдается более выраженная гиперхромия ядер нейронов, в некоторых областях мозга выявлен частичный распад клеток с зональным выпадением последних и явлениями нейронофагии, что указывает на дегенеративные изменения в ЦНС. В целом, эти данные свидетельствуют о прямом действии интермиттирующей вибрации на нейроны головного мозга, что согласуется с результатами В.А. Панкова с соавт., полученными в эксперименте с непрерывным вибрационным воздействием в течение 4 часов в сутки 5 дней в неделю с уровнем виброускорения 138 дБ на основной частоте 40 Гц в течение 15 дней и 1, 2 и 4 месяцев [4].

Заключение. Таким образом, показано, что интермиттирующее вибрационное воздействие на основной частоте 16 Гц, по виброускорению 120 дБ в течение 3-х, 6-и и 9-и недель приводило к увеличению порогов болевой чувствительности у крыс как в тесте «Hot plate», так и в тесте «Tail flick», что связано с общим снижением активности ЦНС и может свидетельствовать о развитии стрессовой реакции и стресс-вызванной аналгезии. Сравнение результатов гистологических исследований, полученных на 3-й, 6-й и 9-й неделях интермиттирующего вибрационного воздействия, показало прогрессирующие морфологические структурные изменения в мозге крыс.