Введение. В ходе высокотемпературных технологических процессов на металлургических предприятиях: плавке, розливе металлов и ряде других производственных операций, в воздух рабочих помещений и прилегающих к ним территорий могут поступать аэрозоли, содержащие наноразмерные частицы [1]. Основной путь их поступления в организм работающего персонала — ингаляционный [2]. Уникальные физико-химические свойства наночастиц: малый размер, способность к агломерации, агрегации и взаимодействию с биомолекулами, определяют как глубину их проникновения в дыхательные пути, так и последующее системное распределение по внутренним органам [3].

Токсическое влияние соединений свинца на организм рабочих изучено достаточно подробно [4–6]. Однако при переходе к наноразмерному диапазону характер и степень токсичности вещества может изменяться, а длительная экспозиция способна приводить к кумуляции частиц в лёгочной ткани и интерстиции [7, 8] и развитию системных эффектов. Кроме того, наночастицы могут проникать через барьерные материалы средств индивидуальной защиты [9], а в реальных условиях многолетнего стажа изучение последствий хронического поступления особенно актуально.

Цель исследования — экспериментальная оценка цито- и пульмонотоксического действия PbO-НЧ при хронической (8 месяцев) ингаляционной экспозиции на модели in vivo.

Материалы и методы. Наноразмерные частицы свинца генерировались методом электрического искрового разряда в атмосфере азота с использованием 99,99% чистого свинцового стержня. Полученные НЧ разбавлялись увлажнённым воздухом (6 л/мин) и окислялись до PbO‑НЧ. Концентрация и идентификация химического состава полученных НЧ была проведена с помощью атомно-абсорбционной спектрометрии в режиме электротермической атомизации. Размер частиц составил 18,2±4,2 нм, массовая концентрация аэрозоля в зоне дыхания животных составляла 0,215 мг/м³, что соответствует близкой к пороговой концентрации, установленной в предшествующих подострых экспериментах [10].

Исследование выполнено на самках крыс линии Wistar в соответствии с международными биоэтическими стандартами работы с лабораторными животными¹ и одобрено локальным этическим комитетом ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП (Протокол № 4 от 12.07.2022). Крысы содержались в специально оборудованном помещении вивария в условиях, соответствующих требованиям нормативных документов²,³. Животные были разделены на две группы по 14 особей: опытную («НЧ PbO») и контрольную. В течение 8 месяцев опытная группа подвергалась ингаляционной экспозиции к PbO-НЧ с использованием установки «только нос» по схеме 5 раз в неделю по 4 часа в день. Во время процедуры животные фиксировались в индивидуальных рестрейнерах для направленной подачи аэрозоля НЧ в зону дыхания. Контрольная группа содержалась в идентичных условиях и подвергалась воздействию чистого нефильтрованного воздуха (без PbO-НЧ) в аналогичной установке.

По завершении периода экспозиции проводили исследование функции внешнего дыхания (ФВД) с использованием системы ecgTUNNEL.

Цитотоксическое действие PbO-НЧ оценивали путём подсчёта альвеолярных макрофагов (АМ) и нейтрофильных лейкоцитов (НЛ) в бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ), которая была получена у семи анестезированных животных из каждой группы. После отбора данного биоматериала производили его пробоподготовку в соответствии со стандартной методикой⁴. Дифференциальный подсчёт клеток проводили в 100 клетках мазка при иммерсионном увеличении (×1000). Пересчёт на абсолютное число клеток проводился с учётом общего числа клеток в камере Горяева. Фагоцитарную активность оценивали по проценту фагоцитирующих клеток (активность фагоцитоза, АФ) и по среднему числу поглощённых латексных частиц размером 1,5 мкм на одну клетку (индекс фагоцитоза, ИФ). Для этого БАЛ инкубировали с латексными частицами при 37°C в течение 20 минут с последующей фиксацией и окраской по Романовскому–Гимзе. Для оценки продукции активных форм кислорода фагоцитирующими клетками применяли нитросиний тетразолиевый тест (НСТ-тест) [11]. При проведении спонтанного НСТ-теста для каждого типа клеток (нейтрофилы и альвеолярные макрофаги) отдельно определяли число активных формазанположительных форм в расчёте на 100 клеток.

Гистоморфологическое исследование лёгких было выполнено оставшимся особям (n=14). Для этого кусочки препаратов фиксировали в 10% забуференном формалине, проводили через батарею спиртов и заливали в парафиновые блоки. На следующем этапе изготавливали срезы толщиной 3–5 мкм. Готовые срезы окрашивали гематоксилином и эозином⁵. Микроскопическое исследование проводили при 80-, 200-, 400-кратном увеличении.

В ткани лёгких был определён уровень экспрессии генов системы детоксикации GSTM1 и GSTP1, а также антиоксидантного гена SOD2 с использованием метода количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) при помощи амплификатора QuantStudio 3. Выделение РНК осуществляли с помощью реагента ExtractRNA («Евроген», Россия) и проводили реакцию обратной транскрипции для синтеза кДНК набором MMLV-RH («Диаэм», Россия). Приготовление смесей для ПЦР и условия амплификации были проведены согласно описанной ранее методике [12].

Статистическая значимость межгрупповых различий средних значений оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони. Изменения экспрессии генов были проанализированы с использованием критерия Манна-Уитни в программе Statistica (StatSoft). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты. В таблице 1 представлены показатели, характеризующие изменения клеточного состава БАЛЖ после 8-ми месяцев экспозиции к PbO-НЧ в ингаляционной установке типа «только нос».

Реакция дыхательной системы крыс на поступление PbO-НЧ проявляется притоком в лёгкие клеток — увеличением числа альвеолярных макрофагов и нейтрофильных лейкоцитов по сравнению с контрольной группой. Ключевой маркер цитотоксичности — отношение НЛ/АМ — превысило контрольный уровень в 4,5 раза.

Результаты исследования иммунологических показателей БАЛЖ отражены в таблице 2.

Хроническое ингаляционное воздействие PbO-НЧ приводило к угнетению функциональной активности фагоцитов. В опытной группе наблюдалось статистически значимое снижение трёх ключевых параметров: ИФ НЛ, АФ АМ и ИФ АМ. Помимо этого, отмечена выраженная тенденция к снижению АФ НЛ и показателя НСТ-теста, отражающего продукцию активных форм кислорода, хотя эти изменения не достигли уровня статистической значимости.

Гистологическая картина лёгких крыс опытной группе характеризуется умеренным утолщением альвеолярных перегородок за счёт склероза и интерстициального отёка, наличием отёчной жидкости в просветах альвеол, перибронхиальными и периваскулярными лимфоцитарно-плазмоцитарными инфильтратами, эмфизематозным расширением альвеол (субплеврально). В полостях альвеол определяется небольшое количество макрофагов, единичные клетки слущенного альвеолярного эпителия. В просветах бронхов среднего и мелкого калибра определяются слущенные клетки мерцательного эпителия, немногочисленные макрофаги. Выявлены единичные бронхи с метаплазией бронхиального эпителия (однослойный многорядный мерцательный), все клетки находятся на базальной мембране. Очагово выявлены клетки с дегенеративными изменениями и потерей ресничек на апикальной поверхности. Стенки бронхов слабо- и умеренно отёчны, выявлены признаки гипертрофии миоцитов. В просветах сосудов обнаруживаются агрегация эритроцитов в виде «монетных столбиков», что может свидетельствовать о повышении вязкости крови. Стенки мелких артерий слабо утолщены. В контрольной группе животных описанные патологические изменения отсутствовали, гистологическая картина лёгочной ткани соответствовала норме.

Результаты оценки ФВД представлены в таблице 3. Хроническое ингаляционное воздействие PbO-НЧ не привело к статистически значимым изменениям спирометрических параметров по сравнению с контрольной группой.

В результате оценки уровня экспрессии генов детоксикационной и антиоксидантной систем (рисунок) было обнаружено, что экспрессия гена GSTP1 у животных опытной группы в лёгком была достоверно ниже в 1,5 раза (p=0,003) по отношению к контрольной группе.

Обсуждение. Первичный контакт PbO-НЧ с АМ вызвал их повреждение и вторичную мобилизацию НЛ в респираторные отделы, что привело к росту индекса НЛ/АМ, отражающего выраженность цитотоксического воздействия [13–15]. Таким образом, достоверно значимые изменения состава БАЛЖ свидетельствуют о проявлении цитотоксического эффекта при хроническом воздействии PbO-НЧ.

В свою очередь, функциональная активность АМ и НЛ, отражённая в исследовании иммунных показателей БАЛЖ, вероятно, указывает на снижение фагоцитарной активности АМ и НЛ вследствие уменьшения поглотительной способности данных клеток, как за счёт их количества (ИФ АМ и НЛ), так и за счёт эффективности поглощения ими НЧ (АФ АМ и НЛ).

Обнаруженные гистологические изменения согласуются с данными других исследований [16, 17]. В частности, выявленная метаплазия бронхиального эпителия является важным признаком хронической регенерации в условиях постоянного повреждения.

В отношении параметров ФВД необходимо подчеркнуть, что отсутствие статистически значимых различий между группами не позволяет сделать вывод о функциональных нарушениях, несмотря на наблюдаемые числовые тенденции.

В тканях лёгкого было отмечено достоверное снижение уровня экспрессии гена GSTP1 и тенденция к снижению экспрессии GSTM1, что может свидетельствовать об угнетении системы глутатионзависимой детоксикации в лёгочной ткани в ответ на проникновение PbO-НЧ. Такое подавление ключевых генов антиоксидантной защиты создаёт порочный круг: НЧ индуцируют окислительный стресс, угнетается система антиоксидантной защиты, окислительный стресс усиливается, что приводит к апоптозу клеток (слущенный эпителий), поддержанию воспаления и фиброзным изменениям (склероз). Полученные изменения в экспрессии генов из-за воздействия PbO-НЧ могут приводить к снижению способности клеток лёгких обезвреживать токсичные метаболиты и нарушению окислительно-восстановительного баланса, вызывая окислительный стресс [18]. Более того, окислительный стресс может напрямую повреждать мембраны и нарушать энергетику фагоцитов, что является вероятным механизмом выявленного угнетения их функциональной активности.

Заключение. Хроническая ингаляционная экспозиция к PbO-НЧ привела к развитию выраженных негативных изменений на различных уровнях организации.

Цитотоксический эффект был подтверждён значимыми сдвигами в клеточном составе БАЛЖ, угнетением фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, а также изменением экспрессии ключевых генов системы детоксикации и антиоксидантной защиты в лёгочной ткани. Патологические изменения в тканях лёгких свидетельствуют об патологических изменениях дыхательной системы. Результаты свидетельствуют о комплексном цито- и пульмонотоксическом действии PbO-НЧ.

Выявление и углублённое изучение патологических изменений в лёгких при хронической ингаляции PbO-НЧ необходимы для понимания динамики развивающихся процессов и являются научной основой для разработки методических рекомендаций и программ профилактических мероприятий, направленных на раннюю диагностику и минимизацию рисков для здоровья человека.

¹ Международные руководящие принципы биомедицинских исследований с участием животных, разработанные Советом по международным организациям медицинских наук (1985). https://clck.ru/3ULgsR (дата обращения: 10 декабря 2025 г.).

² ГОСТ 33216–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами». https://clck.ru/3ULgtf

³ РД-АПК 3.10.07.02–09 Рекомендательные документы. Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений. https://clck.ru/3ULgvg

⁴ Методические рекомендации по использованию клеточных систем «ин витро» и «ин виво» для ускорения гигиенической регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей: МР № 01-19/24-17. Екатеринбург; 1995.

⁵ Кашеваров Г.С., Саитов В.Р., Юсупова К.В., Хафизова А.М., Баймухаметов Ф.З., Яруллин А.И. Методическое пособие по проведению морфологических исследований на тканевом и ультраструктурном уровне. Санкт-Петербург: «Наукоемкие технологии»; 2024. https://elibrary.ru/lipwoh