Введение. Силикоз является хроническим профессиональным заболеванием лёгких из группы пневмокониозов, развивающимся при длительном вдыхании пыли, содержащей диоксид кремния, преимущественно в кристаллической форме, и реже в аморфной. В группу риска входят шахтёры, резчики камня, рабочие карьеров, строители, специалисты по демонтажу зданий, стеклодувы, гончары, пескоструйщики и др. [1, 2].

Согласно современными представлениями патогенез силикоза включает следующие ключевые звенья, приводящие к развитию заболевания:

При патогенезе силикоза особое значение имеют два процесса, происходящих в макрофагах и сопровождающихся участием АФК: во первых, активация фагоцитоза НАДФН оксидазой с генерацией супероксида на поверхности цитоплазматической мембраны [10], во вторых, запуск программ клеточной гибели [11]. Снижение интенсивности этих процессов, с одной стороны, должно сопровождаться уменьшением количества пыли, поглощённой одним макрофагом, а с другой — продлением его жизненного цикла. Можно предположить, что при снижении «нагрузки» пылью и увеличении продолжительности жизни макрофагов возрастает вероятность их удаления из лёгких посредством мукоцилиарного транспорта, что повысит эффективность физиологического самоочищения лёгких от частиц пыли.

Важным патогенетическим фактором развития силикоза является повышенная генерация АФК макрофагами. АФК обладают высокой биологической активностью и участвуют в большом числе биохимических процессов, как физиологических, так и патологических [12, 13]. Имеется значительное количество экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что лекарственные средства с антиоксидантными свойствами, такие как N ацетилцистеин и тетрандин, способны существенно замедлять темпы развития силикоза [14–16]. Вместе с тем механизмы их действия остаются недостаточно изученными. Ситуацию осложняет тот факт, что эти соединения кроме антиоксидантных свойств обладают широким спектром биологической активности, не связанной напрямую с их антирадикальными свойствами [17, 18].

Для выбора препаратов в данное исследование были сформулированы следующие требования: вещество должно обладать системным антиоксидантным действием, быть зарегистрированным в Государственном реестре лекарственных средств, применяться в клинической практике и иметь форму для парентерального введения. Последнее требование было связано с необходимостью унификации пути введения у животных контрольной группы, получавших плацебо. В результате анализа были выбраны два вещества: этилметилгидроксипиридина сукцинат (ЭМГПС) [19] и диметилоксобутилфосфонилдиметилат (ДМОБФДМ) [20].

Цель исследования — оценить возможность использования лекарственных препаратов с антиоксидантными свойствами, доступных в аптечной сети, для стимуляции самоочищения лёгких от частиц кварцевой пыли в модели экспериментального силикоза у крыс.

Материалы и методы. Исследование выполнено на крысах самцах линии Вистар массой 300–350 г, прошедших 14 дневный карантин и содержавшихся в стандартных условиях в соответствии с требованиями ГОСТ 33215 2014¹ и действующими санитарными нормами. Перед экспериментом животным проводили клинический осмотр и исключали особей с признаками патологии.

Стандартный образец кварцевой пыли (СОКП) получали путём седиментации пылевидного кварца, используя методику, изложенную в МР 2673 83²; в качестве исходного материала применяли пылевидный кварц, соответствующий ГОСТ 9077 82³ производства ОАО «Люберецкий ГОК». Полученный образец дополнительно обрабатывали 6 М раствором HCl при 60–70°C в течение 4 ч, промывали дистиллированной водой, сушили при 105°C и отжигали при 900°C в течение 4 ч, после чего контролировали дисперсный состав микроскопически. Массовая доля частиц размером 1–5 мкм составляла не менее 90%.

Интратрахеальное введение кварцевой пыли осуществляли после общей анестезии — внутримышечного введения золетила 100 и дексдомитидина в дозах 50 и 0,025 мг/кг, соответственно. Животных интубировали периферическим венозным катетером 16 G, после чего вводили 50 мг суспензии кварцевой пыли в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия (NaCl). Введение выполняли в вертикальном положении с последующим поверхностным массажем грудной клетки для более равномерного распределения суспензии и снижения риска её самопроизвольного выхода. Все процедуры проводили на термоковриках, поддерживая температуру тела животных в пределах 37–39°C. В конце процедуры для облегчения выхода из наркоза применяли антимедин по 0,05 мг/кг внутримышечно.

Экспериментальные группы. Животных рандомизировали по массе тела на 4 группы по 8 особей. Разделение животных по группам в зависимости от используемой схемы интратрахеального (и/т) и внутрибрюшинного (в/бр) введения представлено в таблице 1.

Определение сухой массы лёгких (СМЛ) и содержания в них кварцевой пыли (СКП). Мокрую (ММЛ) и сухую (СМЛ) массу лёгких определяли гравиметрическим методом, последнюю после высушивания при температуре 105°С до прекращения потери массы. Для определения СКП высушенные лёгкие лизировали в 6Н растворе HCl при 95°С в течение 72 часов. Пробы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин, декантировали верхние ¾ содержимого пробирок, объём доводили до 10 мл этиловым спиртом для удаления из лизата жировой фракции (процедуру повторяли дважды). Пробы повторно центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость, сушили при 105° С и озоляли при 480°С в течение 4 часов. Для удаления остатка водорастворимых примесей в пробирку добавляли 10 мл дистиллированной воды, интенсивно встряхивали, центрифугировали, декантировали надосадочную жидкость и сушили при 105°С до прекращения потери массы. СКП в лёгких определяли гравиметрическим методом, расчёт осуществлялся по формуле (1):

СКП = (С2 – С1) × kп (мг)

где С1 — масса чистой пробирки; С2 — масса пробирки с полученным остатком; kп — коэффициент потерь.

Относительное количество спонтанно удалённой из лёгких кварцевой пыли (ОМКП) определяли по формуле (2), где M1 — масса введённой пыли, а M2 — масса пыли, оставшейся в лёгких после эксперимента [22]. В ходе анализа вычисляли массовый лёгочный коэффициент (МЛК), где МТ — масса тела животного; индекс сухого веса (ИСВ); коэффициент набухания (W/D) и привес, где W1 — масса животного до, а W2 — после эксперимента (формулы 2–6):

Статистическую обработку данных проводили с использованием Microsoft Excel 2019. Применяли описательную статистику (средние M и стандартные ошибки m), проверку нормальности распределения по критерию Шапиро–Уилка и двухвыборочный критерий Стьюдента для сравнения групп; при отклонении от нормального распределения использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Статистическую значимость различий принимали при p<0,05.

Результаты. Было установлено, что в группе № 1 (отрицательный контроль) в течение эксперимента наблюдалось ожидаемое возрастание массы тела, что отражает нормальный процесс развития животных при стандартных условиях (табл. 2). В группах № 2–4, подвергшихся однократному и/т введению кварцевой пыли, прирост массы тела был меньшим, чем в группе отрицательного контроля. Такая тенденция позволяет судить о системном воздействии фиброгенного фактора, сопровождающемся снижением метаболической активности, нарушением общего состояния и ограничением прироста массы тела, что согласуется с характерной для экспериментального силикоза моделью хронического фиброзного поражения лёгких.

В группах № 2–4 показатели "привеса, %" (табл. 3), рассчитанные по формуле (6), были ниже, чем в группе № 1, при этом в группе № 4 различие является статистически достоверным (р<0,05), что подтверждает системное угнетение прироста массы тела на фоне инстилляции кварцевой пыли.

Степень развития силикоза оценивали по увеличению сырой и сухой массы лёгких (табл. 2). В группах № 2–4 мокрая и сухая масса лёгких приблизительно в 2 раза превышали соответствующие значения в контрольной группе № 1 и различались статистически достоверно p<0,05. В группах № 2 и № 4 массы как сырых, так и сухих лёгких были практически идентичны, в группе № 3 несколько ниже, однако различие не достигало уровня статистической значимости.

Массовые коэффициенты показали значительное увеличение МЛК и ИСВ в группе с моделью силикоза (№ 2) по сравнению с контролем (№ 1) (МЛК +230%, ИСВ +245%), что свидетельствует о развитии выраженного фиброза (табл. 3). В группах № 2–4 регистрировали фиброз при одновременном снижении содержания жидкости в лёгких (W/D ≈ 4–5), что интерпретируется как «чистый» фиброз без отёка.

Относительное количество спонтанно удалённой кварцевой пыли было достоверно выше в группе № 3 (ЭМГПС) по сравнению с положительным контролем № 2 (в 1,7 раза; p<0,05), тогда как в группе № 4 (ДМОБФДМ) его уровень не только не превышал, но даже несколько уступал контролю, хотя различие не было статистически значимым (рисунок).

Обсуждение. Интратрахеальное введение суспензии кварцевой пыли в 0,9% NaCl является стандартным способом моделирования силикоза у крыс [23–27]. Двукратное увеличение массы сухих и сырых лёгких в группах № 2–4 подтверждает успешность формирования фиброза, а тенденция к более низкому приросту массы в группе № 4 (ДМОБФДМ) может указывать на некоторую модуляцию фиброзного ответа, хотя статистически значимого влияния препарата на сухую массу лёгких обнаружено не было.

Полученные данные об относительном количестве спонтанно удалённой из лёгких кварцевой пыли свидетельствуют о том, что ЭМГПС стимулирует самоочищение лёгких, а ДМОБФДМ — нет. Наблюдаемое различие можно объяснить тем, что эти вещества принадлежат к различным типам антиоксидантов. ЭМГПС является антиоксидантом прямого действия, то есть вступает в непосредственное химическое взаимодействие с молекулой свободного радикала [28], в то время как ДМОБФДМ является антиоксидантом косвенного действия, механизм работы которого связан с повышением активности супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и каталазы [29]. Как было отмечено во введении, при развитии силикоза ключевую роль играет развитие окислительного стресса в макрофагах. Известно, что внутриклеточный редокс гомеостаз устроен таким образом, что окислительный стресс является стимулирующим фактором для повышения активности внутриклеточных антиоксидантных систем [30]. Поэтому в условиях окислительного стресса дополнительная стимуляция активности этих систем ДМОБФДМ может не иметь эффекта.

Среди стимуляторов самоочищения лёгких от кварцевой пыли следует отметить препарат на основе китайской комбучи (экстракта лекарственных трав, ферментированного чайным грибом), который повышает скорость самопроизвольного удаления пыли более чем в 2 раза [27]. Авторы объясняют этот эффект тем, что в культурах комбучи содержатся две группы симбиотических микроорганизмов: ксилинум и дрожжи. Ксилинум вырабатывает бактериальную целлюлозу из этанола, производимого дрожжами; бактериальная целлюлоза является эффективным адсорбентом, который прилипает к частицам пыли и другим веществам, тем самым облегчая их удаление путём отхаркивания. С объяснением механизма действия авторов трудно согласиться, так как частицы пыли в лёгких достаточно быстро поглощаются макрофагами и в свободном виде практически отсутствуют [22]. Возможно, механизм действия препарата связан с его антиоксидантными свойствами.

Несмотря на снижение количества пыли в лёгких статистически значимого эффекта ЭМГПС на увеличение сухой массы лёгких установить не удалось. Следовательно влияние препарата на динамику развития силикоза пока остаётся не доказанной. Возможно, это связано либо со слишком высокой скоростью развития заболевания, либо недостаточным временем терапии. В работе [25], где изучался эффект антиоксидантов на модели силикоза крыс также отмечалась лишь тенденция через месяц после начала эксперимента, в то время как статистически значимым эффект стал лишь через 2,5 месяца. Известно, что скорость развития фиброза прямо пропорциональна количеству пыли в лёгких и времени её действия. Определение связи между стимуляцией самоочищения лёгких ЭМГПС и динамикой развития силикоза не входило в задачи исследования, чтобы установить её требуется проведение дополнительных экспериментов.

В настоящее время этилметилгидроксипиридина сукцинат (ЭМГПС, референт — «Мексидол»®) эффективно применяется для лечения множества заболеваний благодаря антиоксидантному, мембранопротекторному и антигипоксическому действию [28]. Клинические исследования демонстрируют высокий терапевтический эффект при неврологических (острый/хронический инсульт, дисциркуляторная энцефалопатия, вегетососудистая дистония), психических (невротические/неврозоподобные расстройства, абстинентный синдром при алкоголизме), цереброваскулярных патологиях, возрастных нарушениях мозга (атеросклероз, старение) и острой интоксикации нейролептиками.

Однако способность данного вещества стимулировать самоочистку лёгких от кварцевой пыли установлена впервые, что открывает возможность его применения для профилактики, а также этиотропной терапии пылевых патологий лёгких.

Ранее нами была изучена эффективность бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) как метода удаления кварцевой пыли из лёгких [22]. За месяц БАЛ позволил эвакуировать 25,2±2,8% введённой пыли, что незначительно превышает эффект ЭМГПС (20,1±3,1%). Однако фармакотерапия ЭМГПС проще, дешевле и неинвазивна по сравнению с БАЛ, а их комбинация может обеспечить синергетический эффект [31].

Заключение. Оценка влияния веществ на скорость самоочистки лёгких была рекомендована в качестве одного из способов оценки эффективности средств патогенетической профилактики и терапии пневмокониозов ведущими учёными нашей страны ещё в 1979 году, при этом особо подчёркивалось, что даже небольшое повышение суммарной эффективности физиологических механизмов самоочистки лёгких может иметь существенное значение. Однако до сих пор в отечественной клинической практике лечения пылевых патологий лёгких применение таких веществ отсутствует.

На примере ЭМГПС показана возможность использования лекарственных средств с антиоксидантными свойствами для стимуляции альвеолярного самоочищения лёгких от частиц кварцевой пыли при экспериментальном силикозе у крыс. При этом важно, что антиоксидантный эффект реализован системным препаратом, доступным в аптечной сети и уже применяемым в клинической практике, что повышает перспективу его дальнейшего перевода в профилактические и патогенетические схемы терапии пылевых патологий лёгких. Полученные данные позволяют рассматривать системные антиоксиданты как потенциальные средства модуляции окислительного стресса в альвеолярных макрофагах и повышения эффективности физиологических механизмов удаления фиброгенных пылевых частиц из лёгких, однако их влияние на скорость развития фиброза требует дополнительного изучения в моделях с более длительным наблюдением.

¹ ГОСТ 33215–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур». https://clck.ru/3TqQWZ

² МР 2673–83 «Обоснование предельно допустимых концентраций (ПДК) аэрозолей в рабочей зоне».

³ ГОСТ 9077–82 «Кварц молотый пылевидный. Общие технические условия». https://clck.ru/3TqR4a