Введение. Кадмий (Cd) — широко распространённый в промышленном производстве тяжёлый металл [1–4]. Наибольшее воздействие Cd происходит в металлургической промышленности (на цинковых заводах или в установках по очистке чугуна) [1]. Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что воздействие кадмия может быть связано с некоторыми видами злокачественных новообразований, с развитием заболеваний центральной нервной системы, ухудшением когнитивных и поведенческих функций, и с развитием хронических заболеваний [1, 4, 5]. Почки являются основным органом-мишенью, они наиболее чувствительны к загрязнению Cd [1, 4, 6].

Транспозоны, также известные как мобильные элементы генома, представляют собой последовательности ДНК, способные перемещаться по геному. Ретротранспозоны — это класс транспозонов, реплицирующихся посредством промежуточной РНК. LINE1 (L1), самый распространённый ретротранспозон, занимает около 17% генома человека и является единственным автономным транспозоном, который все ещё активно реплицируется у человека [7]. LINE1 тесно связаны с несколькими видами рака [8]. LINE1 играют сложную роль в развитии рака, выступая одновременно в качестве мутагенных драйверов и потенциальных терапевтических мишеней. Соматические вставки LINE1 могут стимулировать прогрессирование онкологических заболеваний [9–14]. Реактивированные LINE1 могут вызывать реакцию на повреждение ДНК, что приводит к нестабильности генома и поддерживает его противоопухолевые функции при миелоидной лейкемии [15]. Повышенная подвижность LINE1 наблюдалась в результате воздействия некоторых известных канцерогенов, таких как тяжёлые металлы [16, 17], бенз(а)пирен [18] и бисфенол А [19].

Цель исследования — изучение уровня экспрессии транспозонов LINE1 в почках и печени модельных животных, подвергнутых хроническому воздействию различных доз хлорида кадмия.

Материалы и методы. Для эксперимента были сформированы пять групп крыс линии Wistar (общее число 72, самцы и самки, средняя масса тела 180–250 г). Четыре опытные группы (по 7 самок и 7 самцов в каждой) в течение шести месяцев в будние дни получали раствор хлорида кадмия в воде в дозировках 0,001; 0,01; 0,1 и 1 мг/кг. Минимальная концентрация раствора была выбрана в соответствии с референтной дозой при пероральном поступлении металла с продуктами питания и водой (0,001 мг/кг в сутки), установленной Агентством по охране окружающей среды США. Для введения раствора токсиканта был выбран интрагастральный путь, который наиболее точно отражает воздействие кадмия, поступающего в организм с загрязнёнными продуктами питания. Контрольная группа животных получала очищенную воду без примесей в эквиобъёмном количестве. После выведения животных из эксперимента путём декапитации фрагменты почечной и печёночной ткани сразу помещали в пробирки с реактивом ExtractRNA (ЗАО «Евроген», Россия) и замораживали с помощью жидкого азота.

Анализ активности транспозонов LINE1 проводили на приборе BioRad CFX96 методом ПЦР в реальном времени. Уровень транскрипции оценивали относительно экспрессии конститутивного гена Gapdh. Для оценки уровня экспрессии генов применяли метод 2–(ΔΔC(T)) [20]. Статистический анализ и визуализацию результатов проводили с использованием пакетов pandas, numpy, math и scipy.stats на языке Python в программной среде Visual Studio Code. Оценку нормальности распределения проводили с использованием критерия Шапиро–Уилка. Межгрупповые различия оценивали с использованием Н-критерия Краскалла–Уоллиса, различия в дисперсии оценивали с использованием критерия Флигнера–Киллина. При проведении множественных сравнений применялась поправка Бенджамина-Якутелли (результат обозначался как pBY).

Результаты. Проведён анализ уровня относительной экспрессии (транскрипции) ретротранспозонов LINE1 у крыс, получавших хлорид кадмия в течение шести месяцев в тканях печени и почек животных (табл. 1).

Исследован уровень относительной транскрипции транспозонов в печени. Показано дозозависимое повышение уровня экспрессии транспозона в экспериментальных группах, однако различия между медианами не достигли уровня статистической значимости (H=1,04, p=0,90). В тканях почек также показано дозозависимое увеличение уровня транскрипции транспозона, различия не были статистически значимы (Н=2,48, p=0,65). Согласно результатам теста Флигнера-Киллина, дисперсия уровня относительной транскрипции транспозонов LINE1 в тканях печени животных, подвергнутых воздействию хлорида кадмия, не имеет статистически значимых различий (p=0,68), тогда как в тканях почек различия в дисперсии достигли статистически значимого уровня (p=0,01). Попарные сравнения дисперсий между группами крыс, получавших токсикант в различных дозах, с контрольной группой показал, что при дозировке 1 мг/кг дисперсия уровня относительной транскрипции LINE1 значимо выше, чем в контрольной группе (pBY=0,0086).

Для выявления влияния пола на уровень относительной транскрипции транспозов выборка была разделена на подвыборки самцов и самок (табл. 2).

Уровень относительной транскрипции LINE1 в печени самцов крыс в зависимости от полученной дозы хлорида кадмия демонстрирует незначительное повышение уровня экспрессии. Согласно результатам теста Краскалла–Уоллиса, различия между медианами не достигли уровня статистической значимости (H=1,37, p=0,85). Тест Флигнера-Киллина также не показал значимых различий между дисперсиями разных групп (p=0,88).

Уровень относительной транскрипции транспозонов в почках самцов крыс в зависимости от полученной дозы хлорида кадмия позволяет говорить о тенденции к дозозависимому повышению уровня относительной транскрипции LINE1. В тесте Краскалла–Уоллиса различия не достигли уровня статистической значимости (H=1,37, p=0,85), тогда как тест Флигнера–Киллина показал наличие значимых различий в дисперсии разных групп (p=0,03). Попарное сравнение групп с помощью данного теста показало повышение дисперсии в группах, подвергшихся воздействию хлорида кадмия в дозах 0,1 и 1 мг/кг по сравнению с группой контроля, однако после введения поправки на множественность сравнений данные различия не были статистически значимы (p=0,045, pBY=0,27 и p=0,015, pBY=0,18 соответственно).

Наименьший относительный уровень транскрипции LINE1 в печени самок крыс в зависимости от полученной дозы хлорида кадмия наблюдается в группе, получавшей токсикант в дозировке 0,01 мг/кг, а наибольший — в контрольной группе, однако различия не достигли уровня статистической значимости (H=5,78, p=0,22). Тест Флигнера-Киллина также не показал значимых различий в дисперсии групп (p=0,11)

При сравнении уровня относительной транскрипции транспозонов в тканях почек самок также различия между группами не достигли уровня статистической значимости (H=2,18, p=0,70). Тест Флигнера–Киллина также не позволил отвергнуть гипотезу о равенстве дисперсий исследованных групп (p=0,53)

Ранее нами было проведено исследование уровня относительной экспрессии генов металлотинеинов и переносчиков цинка при хроническом воздействии хлорида кадмия [21], и было показано повышение уровня экспрессии генов Mt1a, Mt2a и Mt3 в почках животных при токсическом воздействии хлорида кадмия. В рамках текущего исследования нами проведён корреляционный анализ транскрипционной активности транспозона LINE1 и генов металлотинеинов и переносчиков цинка в печени и почках экспериментальных животных. Согласно полученным результатам, уровень относительной транскрипции LINE1 в тканях печени и почек не показал значимой корреляции с уровнем транскрипции генов в соответствующих органах. При этом уровни относительной экспрессии генов металлотинеинов Mt1a, Mt2a и Mt3 показали слабую положительную корреляцию в тканях почек (0,55<r<0,7, p<0,001). У самцов крыс также была показана слабая положительная корреляция между транскрипцией генов Mt3a, Mt1a и LINE1 в тканях почек (r=0,43, p=0,014 и r=0,55, p=0,001 соответственно). У самок корреляций выявлено не было.

Обсуждение. Оценён уровень относительной экспрессии транспозонов LINE1 на модельном объекте при воздействии кадмия. При оценке результатов работы статистический анализ не показал достоверного повышения уровня относительной экспрессии транспозонов. При оценке дисперсий экспериментальных групп выявлены значимые отличия в группе, получавшей токсикант в дозе 1 мг/кг от контрольной группы, что позволяет говорить о наличии тенденции к повышению активности транспозонов при воздействии токсиканта на организм животного.

Ранее был проведён анализ влияния соединений алюминия на уровень относительной экспрессии LINE1 [22], и было выявлено, что субхроническое воздействие высоких доз солей алюминия способно вызвать повышение активности транспозона. В данной работе токсический эффект был более выражен у самцов, и были больше затронуты ткани почек. Это хорошо согласуется с ролью почек как главного органа выведения соединений тяжёлых металлов из организма и, соответственно, одной из основных мишеней их токсического воздействия [6]. В то же время, в клетках печени воздействие алюминия, как и кадмия не вызвало такого заметного изменения транскрипции LINE1. Такая тканеспецифичность может объясняться более эффективной работой системы детоксикации в печени. Эти результаты согласуются с результатами текущей работы, однако хроническое воздействие кадмия не вызвало статистически значимого эффекта, в отличие от субхронического воздействия алюминия, однако направленность выявленной тенденции схожа.

Заключение. Поступление кадмия в организм индуцирует экспрессию белков металлотинеинов, связывающих его и буферизующих токсическое действие. Изучены ассоциации уровней относительной экспрессии генов Mt1a, Mt2a, Mt3 и гена переносчика цинка Zip1 c уровнем транскрипции LINE1. Показаны слабые ассоциации между уровнями относительной экспрессии генов металлотинеинов и транспозонов.

Полученные результаты позволяют говорить о наличии тенденции к кадмий-индуцированной активации транскрипции транспозонов LINE1 в исследованных органах крыс. Тем не менее, полученный эффект был слабым, и наблюдаемые различия не достигли уровня статистической значимости. При этом значимое увеличение дисперсии в экспериментальных группах позволяет предположить, что активация происходит, но на силу эффекта влияют другие, неучтённые в данном исследовании факторы. Можно предположить, что разница в активации транспозонов опосредована индивидуальными различиями в активности генов системы детоксикации ксенобиотиков и металлотинеинов, что подтверждается результатами проведённого анализа корреляций. Другими факторами, ограничивающими активность транспозонов является полиморфизм систем репарации повреждений, что обусловливает разную степень индивидуальной устойчивости к токсическому воздействию, и различия в работе системы контроля за активностью транспозонов.