Введение. С необходимостью пребывания в гипербарических условиях наиболее остро человек сталкивается в процессе освоения глубин мирового океана. Процессы перехода, пребывания в условиях повышенного давления среды и последующей декомпрессии сопровождаются воздействием на организм целого ряда факторов, в том числе обусловленных физическими процессами, описанными газовыми законами, в первую очередь — законами Бойля–Мариотта и Генри [1, 2]. Без соответствующих профилактических мер последствия гипербарического воздействия и перехода к нормальным условиям могут быть смертельно опасными вследствие возникновения специфических заболеваний, таких как декомпрессионная болезнь (ДКБ), кислородное отравление, токсическое действие азота, а также травм, например баротравмы лёгких и других воздухоносных полостей организма [3–6].

ХХ век ознаменовался бурным развитием технического, методического и медицинского обеспечения водолазных работ. Важным достижением стало внедрение в практику использования искусственных дыхательных газовых смесей и их комбинаций в разные периоды водолазного спуска, а также разработки безопасных режимов компрессии и декомпрессии [7–9]. Однако неизбежное наличие в дыхательных смесях газов–разбавителей, не участвующих в процессе метаболизма, но необходимых для поддержания строго необходимого количества кислорода в смеси, по-прежнему остаётся одним из ключевых факторов в процессе освоения гипербарии.

В 1962 г. был предложен принципиально новый подход, позволяющий избежать наличия чрезмерного количества газов-разбавителей в дыхательном субстрате, используя для дыхания жидкость, осуществляющую газотранспортные функции в отношении кислорода и углекислого газа. Экспериментально доказанный феномен стал широко известен как «жидкостное дыхание» (ЖД) [10–12]. Особенность ЖД состоит в том, что респираторные объёмы не требуют наличия безучастных в метаболизме газов и остаются практически неизменными даже при значительных изменениях давления окружающей среды. Это позволяет говорить о возможности профилактики травм, вызываемых увеличением (при декомпрессии) или уменьшением (в процессе компрессии) объёмов воздухоносных полостей организма [13, 14]. Кроме того, дыхательная жидкость (ДЖ), не имеющая прямого контакта (газообмена) с гипербарической газовой средой, лишена чрезмерного количества кислорода и газов-разбавителей, а, следовательно, не будет насыщать ими ткани организма, устраняя первопричину целого комплекса патологий, в том числе декомпрессионную болезнь [6, 15, 16]. Указанные свойства метода ЖД позволяют говорить о колоссальных преимуществах такого подхода в вопросах освоения гипербарической среды.

Тем не менее способность этой технологии предотвращать развитие патологических состояний не снимает закономерный вопрос о сохранности сознательной деятельности в процессе ЖД, что необходимо для понимания возможностей его практического применения. Ранее было установлено, что в условиях нормобарии условно-рефлекторная деятельность (УРД) у мелких лабораторных животных, дышащих спонтанно в ДЖ, сохраняется [17], но данные о её сохранности в условиях гипербарии в настоящее время отсутствуют.

Цель исследования — оценить сохранность условно-рефлекторной деятельности у мелких лабораторных животных при самостоятельном жидкостном дыхании в иммерсии в дыхательной жидкости в условиях гипербарии.

Материалы и методы. Исследование выполнено на половозрелых самцах сирийских хомяков возрастом 4 месяца и массой 120–140 г. В исследовании использовались карантинированные животные, ранее не находившееся в эксперименте и содержащиеся на стандартном водном и пищевом рационе в отдельном помещении¹,².

Методика исследования основана на предварительной выработке у мелких лабораторных животный условного рефлекса активного избегания [17] с последующим его подтверждением в гипербарических условиях в процессе спонтанного ЖД в иммерсии в оксигенированной ДЖ.

Исследование было выполнено с использованием шестиуровневого лабиринта (далее — лабиринта), позволяющего изучать УРД у мелких лабораторных животных как в газовой, так и в жидкостной среде [17].

Для моделирования гипербарического воздействия был использован гипербарический стенд, разработанный ФГАОУ ВО «Севастопольский государственный университет», использующий воду либо перфторуглеродную жидкость в качестве рабочей среды.

Гипербарическая камера стенда представляет собой вертикально установленный цилиндрический сосуд с внутренним диаметром 347 мм, длиной 1000 мм и толщиной стенки 15,2 мм, оснащённый байонетным затвором с ручным приводом и противовесом (ЗКБ 350.10.000 DN350 PN160), обеспечивающим время цикла «закрытие/открытие» не более 1 мин.

Стенд предназначен для изучения влияния ЖД на мелких и средних лабораторных животных в условиях иммерсии в ДЖ в гипербарической среде.

Стенд позволяет имитировать натурные испытания, в том числе воспроизводить динамику изменения давления при погружении/всплытии с различными скоростями, обеспечивать температурные параметры иммерсионной жидкости в диапазоне от 1,0 до 40,0°С, а также проводить регистрацию функциональных показателей испытуемых биообъектов.

Исследование было выполнено в два этапа. На первом этапе у животных вырабатывали условный рефлекс активного избегания утопления в условиях дыхания атмосферным воздухом в нормобарии. Для этого аквариум заполняли водой, комнатной температуры (20,0–22,0°С) таким образом, чтобы площадка верхнего уровня погружаемого лабиринта находилась под водой. Животное фиксировали на стартовой позиции нижнего уровня, затем лабиринт начинали плавно погружать в аквариум. Подбиралась такая скорость погружения, при которой голова животного находилась над уровнем воды. Угроза утопления побуждала освобождённое с фиксатора животное к перемещению на вышерасположенный уровень. Тренировки проводили три раза в день в течение 10 дней. Степень тренированности животного оценивалась по наименьшему времени прохождения лабиринта, зарегистрированному на 10-й день [17].

На втором этапе изучалось влияние ЖД на состояние УРД животных в условиях гипербарии. В качестве ДЖ был использован перфторгексан (ПФГ: C6F14, CAS 355-42‑0, содержание ПФГ — 99,9%, производства ООО «ПКФ «СпецНефтеПродукт», Россия).

Исследование проводилось на следующий день после завершения обучения. При оценке УРД в условиях ЖД аквариум заполняли оксигенированным перфторгексаном заданной температуры. Оксигенация ДЖ проводилась методом барботирования с помощью концентратора Nidek Mark 5 nuvo Lite (США) в течение часа с расходом кислорода 3 л/мин. Концентрация кислорода в ДЖ определялась с помощью кислородомера Актаком АТТ-3010 с функцией термометра (Россия).

Перед тестированием у животного измеряли ректальную температуру (Трект). Лабиринт с животным, фиксированным на нижнем уровне лабиринта с помощью электромагнитного замка с дистанционным управлением, быстро помещали в аквариум, предварительно наполненный оксигенированной до 90,0 об% ДЖ, температурой (ТДЖ) 27,0°С и закреплённый в гипербарическом стенде. На верхней границе ДЖ размещали сетку для предотвращения выхода животного в рабочую среду стенда (воду) и последующего утопления. Затем закрывали байонетный затвор стенда и повышали давление до заданной величины, затем животное снимали с фиксации. Наблюдение за животным во время прохождения лабиринта осуществляли с помощью видеокамеры. После завершения тестирования проводили декомпрессию, открывали байонетный затвор, извлекали животное из стенда и повторно измеряли ректальную температуру. Животным контрольной группы проводили тестирование в условиях нормобарии.

Если животное не проходило лабиринт в течение 5 минут после снятия с фиксации, тестирование прекращали. По завершению декомпрессии животное извлекали из стенда, регистрируя уровень лабиринта, на котором оно находилось.

Состояние УРД оценивали по времени прохождения лабиринта (которое определялось от момента снятия с фиксации), а в случае завершения тестирования по истечению контрольного времени — по уровню, на котором находилось животное на момент извлечения из стенда.

Распределение животных по группам в зависимости от условий проведения тестирования представлено в таблице 1.

Животных, прошедших тестирование, наблюдали в течение 7 дней после ЖД, оценивали общее состояние животных в динамике и выживаемость. Всем погибшим животным проводили некропсию.

Патоморфологическое исследование включало в себя аутопсию, макро- и микроскопическое (гистологическое) исследование внутренних органов. Фрагменты исследуемых органов фиксировались в 10% растворе забуференного формалина в течение 24 часов, далее материал проходил стандартную обработку в изопропиловом спирте и парафине для изготовления гистологических препаратов. Для микроскопического исследования срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Морфологическое и микроморфометрическое исследование гистологических препаратов, проводилось при помощи светооптического микроскопа Leica DM LS (Германия), оснащённого окуляр-микрометром, микрофотографирование при помощи цифровой фотокамеры Leica DC320.

Статистическая обработка результатов производилась с использованием пакета программа Statistica 6,0 для Windows. Расчёт средних величин регистрируемых показателей проводился общепринятыми статистическими методами. В случае нормального распределения показателей в экспериментальных группах и равенства дисперсий использовались методы параметрической статистики (сравнения показателей с использованием t-критерия Стъюдента для связанных и несвязанных выборок). Для сравнения средних величин и установления статистической значимости различий с контролем при отсутствии признаков нормального распределения проводили статистическую обработку по непараметрическим тестам (Вилкоксона для связанных и Манна–Уитни для несвязанных выборок).

Результаты. В рамках первого этапа у животных был выработан условный рефлекс активного избегания утопления в условиях дыхания воздухом. По результатам тестирования на основании тренированности животных были сформированы 2 экспериментальные группы по 10 животных в каждой. Среднее время прохождения лабиринта животными в сформированных группах I и II составило 4,9±1,2 и 5,0±1,6 сек. соответственно.

При выполнении второго этапа исследования было установлено, что в I-ой группе все животные успешно прошли лабиринт со среднем временем 45±12 сек. (табл. 2). В свою очередь во II-ой группе только 60% животных полностью прошли лабиринт. При этом среднее время прохождения лабиринта во II-ой группе было в 1,69 раза больше, чем в I-ой.

Также обращало на себя внимание что в процессе ЖД у животных всех групп наблюдалось существенное снижение ректальной температуры (табл. 2). Так, разница Трект до и после исследования в I и II группах составляла 6,0 и 8,1°С соответственно. Снижение Трект непосредственно зависело от продолжительности иммерсии животных в дыхательной жидкости во время ЖД.

При оценке исходов ЖД было установлено, что гибель животных после ЖД перфторгексаном в I и II группах составляла 70 и 90%. В свою очередь в I-ой и II-ой группах гибель регистрировалась либо в ранние сроки (в течение первого часа после тестирования), либо в поздние (в середине первых – начале вторых суток) (табл. 3).

У животных, погибших в ранние сроки после перехода на газовое дыхание, по прошествии непродолжительного скрытого периода, быстро нарастали явления острой дыхательной недостаточности, являвшиеся непосредственной причиной неблагоприятного исхода. В свою очередь в поздние сроки гибель также развивалась на фоне быстро прогрессирующей дыхательной недостаточности, возникшей после скрытого периода в середине первых – начале вторых суток с момента ЖД.

При патологоанатомическом исследовании погибших животных всех групп было установлено, что ткань лёгких с поверхности и на разрезе гладкая, светло-красного цвета, на ощупь тестоватая, с поверхностей разрезов стекает незначительное количество тёмно-красной жидкой крови. Головной мозг дряблый, расползается при исследовании. Все внутренние органы полнокровны.

При микроскопическом исследовании альвеолы незначительно расширены, пустые, капилляры полнокровны (рис. 1А), перегородки сильно истончены (рис. 1Б). Отмечался умеренно выраженный периваскулярный (рис. 2А) и перицеллюлярный (рис. 2Б) отёк вещества головного мозга. Миокард с полнокровными расширенными венами, эндокард тонкий, с единичными очаговыми субэндокардиальными кровоизлияниями. В печени наблюдалось резко выраженное полнокровие и расширение центральных вен, вен портальных трактов, а также капилляров синусоид. Почка с резким полнокровием капилляров клубочков и интерстиция. Со стороны других органов и тканей изменений выявлено не было.

Обсуждение. Изучение УРД в рамках настоящего исследования было сопряжено с целым рядом сложностей, как технического, так и методического характера. Одной из них был выбор биологического объекта, который бы позволил изучить интересующие нас показатели при самостоятельном ЖД в иммерсии в ДЖ при воздействии повышенного давления среды. В качестве такого объекта были выбраны сирийские хомяки, которые, как показали предварительные исследования, в отличии от других видов мелких лабораторных животных в полной мере соответствовали предъявляемым в рамках настоящего исследования требованиям к биомодели. Вторым фактором было создание оборудования, позволившего изучить УРД на мелких лабораторных животных, находящихся на самостоятельном ЖД в иммерсии в ДЖ в гипербарии. Ранее нами было обосновано использование для оценки УРД у сирийских хомяков, находящихся на самостоятельном ЖД условного рефлекса активного избегания, а также разработан многоуровневый лабиринт, позволяющий осуществить указанные выше исследования, и методика их проведения в условиях нормобарии [17]. Учитывая то обстоятельство, что существенное влияние на результаты тестирования оказывают как физико-химические свойства ДЖ, так и её температура [10] нами был использован для проведения исследований перфторгексан температурой 27,0°С, показавший наилучшие результаты при изучении УРД на выбранной нами биомодели в условиях нормобарии [17].

В процессе исследования было установлено, что в гипербарии наблюдалось снижение УРД по сравнению с нормобарией, что могло быть связано как с угнетающим действием повышенного давления среды и гипотермии, так и развитием дыхательного ацидоза и гипоксии вследствие неэффективности спонтанного дыхания.

В свою очередь результаты наблюдения за животными, также, как и данные патологоанатомического исследования свидетельствуют о том, что гибель животных как в ранние, так и в поздние сроки, после ЖД как в нормо-, так и в гипербарии была связана с острым повреждением лёгких (ОПЛ), приводившим к развитию острой дыхательной и сердечно-сосудистой недостаточности. Обращало на себя внимание, что сроки гибели животных во всех группах зависели от продолжительности жидкостного дыхания. Что в свою очередь свидетельствовало о том, что непосредственной причиной развития ОПЛ являются перфторгексан, который оказывает выраженное пульмонотоксическое действие [17].

Следует также отметить, что при патологоанатомическом исследовании четырёх животных II группы, не прошедших полностью лабиринт, пребывавших под избыточным давлением 1,2 МПа в течение 350±2 сек. и погибших в первый час после декомпрессии, признаков декомпрессионной болезни выявлено не было. В то время как пребывание сирийских хомяков в среде сжатого воздуха под избыточным давлением 1,2 МПа в течение 300 сек. с последующей декомпрессией с указанной скоростью в 100% случаев вызывало газообразование в крупных сосудах и полостях сердца, регистрируемое с помощью УЗИ и при патологоанатомическом исследовании в серии предварительных экспериментов.

Ограничения исследования. Наиболее важные ограничения, требующие использования новых методологических подходов, накладывались условиями гипербарической среды, а также наличием эпизода самостоятельного ЖД животных в иммерсии в ДЖ. Статьи других исследователей, посвящённые оценке УРД у животных в подобных условиях, ни в отечественной, ни в зарубежной литературе не представлены в свободном доступе.

Как уже было отмечено, сирийские хомяки были выбраны как единственные стабильно устойчивые к спонтанному дыханию среди других мелких лабораторных животных, что существенно ограничивает прямую экстраполяцию результатов на человека.

Существующие технические решения для оценки УРД, такие как «челночная камера» и её модификации [18] и другие [19, 20], не создали бы условия для демонстрации УРД животными, погружёнными в диэлектрическую жидкость. Разработанный многоуровневый лабиринт, в свою очередь, позволил реализовать известный подход к оценке УРД путём выработки условного рефлекса активного избегания новым способом. Однако представленный поведенческий тест не охватывает все аспекты высшей нервной деятельности.

Стандартизированный узкий диапазон гипербарического воздействия и использование конкретной перфторуглеродной жидкости, так же можно отнести к ограничениям, принятыми нами для достижения цели исследования. 

Выводы:

1. Многоуровневый лабиринт может быть использован для изучения влияния дыхательных жидкостей и температурных режимов их использования на состояние условно-рефлекторной деятельности мелких лабораторных животных в условиях гипербарии.

2. Для оценки в гипербарических условиях условно-рефлекторной деятельности мелких лабораторных животных при жидкостном дыхании в иммерсии в оксигенированной дыхательной жидкости может быть использован условный рефлекс активного избегания утопления, выработанный в газовой среде при атмосферном давлении.

3. При самостоятельном жидкостном дыхании в иммерсии в дыхательной жидкости в гипербарии наблюдается снижение показателей условно-рефлекторной деятельности, которое может быть вызвано как непосредственным влиянием повышенного давления окружающей среды, так и другими факторами, в том числе и развивающейся гипотермией.

4. Жидкостное дыхание в иммерсии в дыхательной жидкости предотвращает развитие баротравмы лёгких и внутренних полостей организма, а также кессонной (декомпрессионной) болезни при использовании ультрабыстрых режимов декомпрессии.

5. Использование перфторгексана в качестве дыхательной жидкости как в нормо-, так и в гипербарии приводит к гибели лабораторных животных, связанной с развитием у них острого повреждения лёгких, приводящего к острой дыхательной, а в дальнейшем и острой сердечно-сосудистой недостаточности. Причём развитие острого повреждения лёгкого непосредственно зависит от продолжительности самостоятельного жидкостного дыхания: чем больше продолжительность, тем быстрее развивается острое повреждение лёгких, а, следовательно, и неблагоприятный исход.

¹ ГОСТ 33215–2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур: межгосударственный стандарт. М.: Стандартинформ; 2015. 12 с.

² ГОСТ 33216–2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами: межгосударственный стандарт. М.: Стандартинформ; 2016. 16 с.